熱量限制對Kkay小鼠氧化應激和血脂代謝的影響

陳 莉，趙健紅，張霽雯

上海市寶山區羅店醫院檢驗科(上海201908 )

近年來，隨著生活水平和飲食結構的改變，老齡化及肥胖率的增加，糖尿病的患病人數快速增加，已成為嚴重的公共衛生問題。據調查顯示，2015年世界成人患病率為8.8%[1]，而我國糖尿病患病率已經高達12.6%[2]。糖尿病發病機制尤為復雜，是由多基因遺傳和環境因素引起的，一旦確診，需終身治療,同時糖尿病會誘發各種心腦血管疾病的發生[3]。環境因素中飲食結構的改變和體力活動減少而引起的肥胖在糖尿病的發病中起到重要作用，飲食控制對肥胖及糖尿病患者來說是最經濟、最有效的控制手段之一[4]。飲食控制的主要是能量的限制，即熱量限制(Calorie restriction，CR)。熱量限制不僅可以預防多種遲發性疾病，延緩衰老，延長壽命[5]，而且在糖尿病等心血管疾病中發揮重要作用[6]。研究表明氧化應激是發生糖尿病等心血管疾病的主要機制之一，氧化應激是誘發糖尿病的發生因素之一[7]，而氧化應激與血脂異常在糖尿病微血管病變中也具有重要作用[8]。本研究利用糖尿病模型Kkay小鼠，探究熱量限制對Kkay小鼠炎性因子和血脂代謝的影響，為熱量限制控制糖尿病提供理論依據。

材料與方法

1 動物來源 從北京華阜康生物科技有限公司購買16只8周Kkay小鼠作為試驗組，體重為35～45 g,另購買8周C57BL/6J小鼠8只，體重為25～35 g。維持12 h光照和12 h黑暗的晝夜節律。實驗室溫度: 20～25 ℃，濕度：(50±5)%，自由飲水。Kkay小鼠喂養kkay專用飼料(北京華阜康生物科技有限公司)，C57BL/6J喂養普通飼料，干預前適應性喂養1周，自由飲食。

2 實驗儀器 血糖儀與血糖試紙購自美國羅氏公司；動物血清甘油三酯(TG)、膽固醇(TCH)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)及高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)血脂檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究有限公司；超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD) 、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px) 試劑盒購于南京建成生物工程研究所有限公司。

3 動物分組與處理 將16只Kkay小鼠按照隨機數字表的方法隨機分為kkay對照組(kkay組，n=8只)，熱量限制組(CR組，n=8只)；另外8只C57小鼠作為常規對照(C57組，n=8只)；kkay組與C57組小鼠給予自由飲食，每天記錄下小鼠飲食攝入量，CR組飲食攝入量為kkay組小鼠攝入量的60%[7]，干預持續12周，每隔4周測各組小鼠的血糖、體重，于干預前，干預后第4周、8周及12周各測一組。

4 血清的采集與處理 各組大鼠干預12周后，大鼠腹腔注射麻藥(2%戊巴比妥45 mg/kg),下腔靜脈取血，3000 r/min離心10 min，取上清-20 ℃保存待用。血脂檢測采用生化試劑盒，WST-1 法測定血清中SOD 活性; 過氧化物酶微量測定法檢測血清中GSH-Px 的含量。

結果

1 熱量限制對Kkay小鼠血糖的影響 干預前，兩組Kkay小鼠血糖為(10.34±0.85) mmol/L，對照C57組小鼠血糖為(6.62±0.63) mmol/L，Kkay小鼠血糖與C57小鼠血糖差異具有統計學意義(P<0.001)；由表1發現C57組與kkay組干預前至干預第12周期間，血糖均趨于穩定，而對Kkay小鼠熱量限制后，干預CR組血糖隨著干預時間的延長，血糖逐漸下降，干預至第8周后，CR組Kkay小鼠血糖顯著低干預水平(P=0.03)，同時較kkay組血糖仍顯著下降(P<0.001)，趨于正常對照C57水平，但仍與C57血糖水平差異具有統計學意義(P<0.001)。

表1 熱量限制對Kkay小鼠血糖的影響(mmol/L)

注：與C57組相比，*P<0.05；與kkay組相比，△P<0.05；各干預組中，與干預前相比，#P<0.05

2 熱量限制對Kkay小鼠體重的影響 干預前兩組Kkay小鼠體重為(39.87±4.62)g，顯著高于正常對照C57組，差異具有統計學意義(P<0.001)；正常對照C57組小鼠和kkay組小鼠隨著干預時間的增加，體重逐漸增加，而干預CR組體重較為穩定，并有略微下降，干預至第12周，CR組小鼠體重低于kkay組(P<0.001)。見表2。

表2 熱量限制對Kkay小鼠體重的影響(g)

注：與C57組相比，*P<0.05；與kkay組相比，△P<0.05；各干預組中，與干預前相比，#P<0.05

3 熱量限制對Kkay小鼠血脂代謝的影響 由表3可以看出，干預12周后，kkay組小鼠血清TCH、TG及LDL-C水平顯著高于C57組，熱量限制后，CR組血清TCH、TG及LDL-C水平顯著降低(P<0.05)，其中血清TG水平降為正常對照C57組水平，TCH與LDL水平仍與正常對照C57組有一定的差異(P<0.05)；而kkay組小鼠血清HDL-C水平顯著低于C57組，對Kkay小鼠給予熱量限制后，其血清HDL-C與Kkay小鼠差異無統計學意義，仍低于C57組。

表3 熱量限制對Kkay小鼠血脂代謝的影響(mmol/L)

注：*表示與C57組相比，P<0.05；△表示與kkay組相比，P<0.05

4 熱量限制對Kkay小鼠氧化應激的影響 由表4可以看出，kkay組小鼠血清中SOD水平和GSH-Px水平顯著低于C57組，而給予12周的熱量限制后，CR組Kkay小鼠血清SOD和GSH-Px水平顯著改善(P<0.05)，但仍與C57組小鼠血清炎性因子有一定的差異(P<0.05)。

表4 熱量限制對Kkay小鼠氧化應激的影響

討論

2型糖尿病是一組以胰島素抵抗和胰島素分泌減少的為特征，以高血糖為表現形式的慢性代謝性疾病[9]。糖尿病會誘發各種心腦血管疾病的發生，是導致糖尿病患者死亡的主要原因[10]。大量的氧化應激會刺激應激敏感信號系統，破壞胰島β細胞功能，胰島素分泌減少，最終導致胰島β細胞凋亡及胰島素抵抗，增加葡萄糖的耐受，進而誘發2型糖尿病[11]。另外氧化應激微血管病變中也具有重要作用，大量的活性氧可直接導致大量心肌細胞凋亡，最終導致心力衰竭[12]

糖尿病模型Kkay小鼠是國內外較為常用的自發性糖尿病模型[13]。此小鼠攜帶有肥胖的易感基因，在高脂飼料誘導下，喂養4周后小鼠即出現肥胖，高血糖，胰島素抵抗，高脂血癥，發病機制是高脂肪飲食的攝入[14]，因此其能更好的模擬糖尿病是有遺傳因素和環境因素相互作用引起的。本研究可以發現Kkay小鼠體重和血糖顯著高于對照C57組，同時Kkay小鼠長期處于較高的氧化應激狀態， kkay組小鼠血清TCH、TG及LDL-C水平顯著高于C57組，出現顯著脂質代謝紊亂。

發達國家往往由于其食物以高脂肪高蛋白的食物為主，其糖尿病的患病率較高，而過去以淀粉為主食的包括我國在內東亞國家脂肪和蛋白質的攝入量增加，糖尿病的患病率也增加，其飲食結構的改變主要體現在高熱量飲食[15]。飲食控制對肥胖及糖尿病患者來說是最經濟、最有效的控制手段之一。飲食控制的主要是能量的限制，即熱量限制(CR)。熱量限制是指減少20%～40%日常所需攝入的能量，而保證必須營養素的攝入，保證正常的生理功能[16]。熱量限制不僅可以預防多種遲發性疾病，延緩衰老，延長壽命[17]，而且在糖尿病等心血管疾病中發揮重要作用。Gao等研究發現，對高脂喂養的C57給予40%的熱量限制，可以減輕肥胖小鼠的體重，恢復小鼠的糖耐量，提高機體對胰島素的敏感性，延緩向糖尿病的轉歸[18]。Lean對157例糖尿病患者給予度低熱量飲食，干預3-5個月，之后隨訪12個月發現高達46%的患者糖尿病癥狀完全緩解，不需要藥物就可控制良好[19]。本研究同樣發現，對Kkay小鼠熱量限制后，其體重和血糖顯著降低；CR組血清TCH、TG及LDL-C水平顯著降低，Kkay小鼠血清SOD和GSH-Px水平升高，小鼠的氧化應激和脂質代謝發生顯著改善。這與Ishida等研究相似，其機制可能是熱量限制通過氧化應激等途徑使β細胞的特異性轉錄因子的表達具有可逆性，β 細胞去分化顯著降低。改善胰島β細胞功能[20]。因此我們認為熱量限制可以改善糖尿病小鼠氧化應激和血脂代謝，為糖尿病的治療提供新的思路。