高產(chǎn)抑制大腸桿菌血凝性的胞外多糖的解淀粉芽孢桿菌

蔡國林，馮文旭，劉逸凡，李曉敏，陸健*

1(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)2(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)3(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

芽孢桿菌可以調(diào)節(jié)動物腸道菌群，不但可以降低腸道疾病的風險，特別是由產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(enterotoxigenicEscherichiacoli, ETEC)導致的腹瀉，還可以提高動物的生長性能，因此被廣泛應用于動物養(yǎng)殖中[1-2]。商品化的芽孢桿菌一般以孢子形式存在，由于芽孢耐熱，且具有低pH耐受性，有益于飼料的加工及腸道的存活率。大約10%的芽孢能最終在動物的消化道內(nèi)重新萌發(fā)[3]。芽孢在重新萌發(fā)、生長和增殖的過程中，會消耗系統(tǒng)內(nèi)的氧氣，促進乳酸菌和雙歧桿菌等有益菌的生長，并產(chǎn)生一系列有益的代謝產(chǎn)物，如各種有益于飼料養(yǎng)分降解的消化酶和抑制有害微生物生長的抗菌肽等[4]。

然而，最近的研究表明，益生菌產(chǎn)生的胞外多糖也是其益生作用的重要方面。比如來自植物乳桿菌的胞外多糖具有類似抗壞血酸的抗氧化性能，以及降低膽固醇和抑制α-淀粉酶的能力[5]；胞外多糖還可以選擇性地促進有益菌的增殖，進而抑制有害菌的增殖和有害物質(zhì)的產(chǎn)生[6]；有些乳酸菌的胞外多糖能夠去除重金屬離子，阻止其在腸道中被吸收而進入血液[7]；此外，多種乳酸菌的胞外多糖還表現(xiàn)出調(diào)節(jié)宿主免疫性能和抑制腫瘤細胞增殖的能力[8]。然而，目前對芽孢桿菌胞外多糖的益生作用研究很少，僅有文獻報道芽孢桿菌胞外多糖具有抗氧化作用[9]，這不利于深入研究芽孢桿菌益生作用的機理及其精準調(diào)控。目前防治ETEC導致的腹瀉主要是采用抗生素治療，這可能導致細菌耐藥性增強和食品中藥物殘留等問題，而卵黃抗體粉和多價疫苗等新型的防治手段，導致養(yǎng)殖成本增加大，難以被養(yǎng)殖企業(yè)所接受。

本研究主要通過篩選獲得高產(chǎn)胞外多糖的芽孢桿菌，考察其胞外多糖對ETEC介導的血凝反應的抑制作用，結(jié)合芽孢桿菌耐受人工腸、胃液和抗生素敏感性，評價其飼用益生潛力，為今后在動物養(yǎng)殖中的應用及研究其胞外多糖對大腸桿菌病的精準防治奠定良好的基礎。

1 材料與方法

1.1 芽孢桿菌的分離與初步篩選

取新鮮的健康仔豬糞約1 g于100 mL無菌的生理鹽水中，80 ℃水浴30 min，將處理后的樣品稀釋涂布于LB平板。30 ℃培養(yǎng)48 h后挑取典型的芽孢桿菌菌落，在新鮮的LB平板上純化培養(yǎng)24 h，挑取單菌落至LB斜面保藏備用。

將保藏的菌株分別在LB液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h，采用平板計數(shù)法測定活菌總數(shù)A0，菌液經(jīng)80 ℃處理30 min后，采用平板計數(shù)法測定芽孢數(shù)A1。菌株的產(chǎn)孢率按公式(1)計算[10]。

(1)

1.2 芽孢桿菌胞外多糖產(chǎn)量分析

將分離獲得的高產(chǎn)孢率的芽孢桿菌接種于含100 g/L蔗糖的LB培養(yǎng)基中37 ℃發(fā)酵72 h。發(fā)酵液經(jīng)8 000×g離心30 min，去除菌體與雜質(zhì)，上清液中加入3倍體積無水乙醇，于4 ℃過夜沉淀，8 000×g離心30 min去除上清，將沉淀用去離子水復溶后，經(jīng)8 000 u透析袋透析2 d，每隔8 h換水，收集透析液并定容，采用苯酚-硫酸法測定胞外多糖的含量[11]。

1.3 芽孢桿菌胞外多糖抑制血凝反應能力分析

血紅細胞的血凝反應通過ETEC介導，按照WANG等[12]的方法進行，ETEC CICC10421 (O78∶K80)購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。采集新鮮雞血用PBS生理鹽水(100 mmol/L，pH 7.2)反復洗滌離心5次，最后用PBS生理鹽水將紅細胞懸浮液稀釋為50 g/L，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩TEC在Minca瓊脂上培養(yǎng)過夜，然后用PBS生理鹽水沖洗，制備8.0×109CFU/mL的菌懸液。取25 μL含有8.0×109細菌細胞的ETEC懸浮液置于圓底96孔板中并且稀釋2倍，加入25 μL含有不同濃度的芽孢桿菌胞外多糖(以甘露聚糖為陽性對照)，室溫放置5 min。最后加入25 μL懸浮在PBS中的5%紅細胞懸浮液輕輕混合。在4 ℃放置2 h后觀察96孔板中紅細胞凝集情況，記錄首次出現(xiàn)抑制血凝反應的多糖濃度。

Minca瓊脂：KH2PO41.36 g， Na2HPO4·2H2O 10.1 g，葡萄糖1 g，酪蛋白氨基酸1 g，去離子水1 000 mL，1 mL微量鹽溶液(MgSO4·7H2O 10 g，MnCl2·4H2O 1 g，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.135 g，CaCl2·4H2O 0.4 g, 去離子水1 000 mL)，瓊脂12 g。

1.4 芽孢桿菌耐胃酸和腸液能力分析[13]

人工胃液：將1.0 g胃蛋白酶充分溶解于100 mL的生理鹽水中，用2 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH值分別為2.0、3.0和4.0，采用0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌，備用。人工腸液：取KH2PO46.8 g，加蒸餾水500 mL溶解，用0.1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至6.8，加水定容至1 000 mL，加入1.0 g胰蛋白酶和3.0 g牛膽鹽，充分溶解后經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌，備用。

將1 mL芽孢懸浮液(1.0×108CFU/mL)接入9 mL人工胃液，37 ℃振蕩水浴處理2 h后進行活菌計數(shù)，每個處理重復3次。將經(jīng)過pH 3.0人工胃液處理后的芽孢離心，生理鹽水洗滌2次后重新懸浮，以1.0×107CFU/mL接種于上述人工腸液中，37℃振蕩水浴處理，分別在0.5、1、2 h取樣進行活菌計數(shù)，每個處理重復3次。

1.5 抗生素抗性和產(chǎn)抗生素能力分析

抗生素敏感實驗根據(jù)Clinical and Laboratory Standards Institute推薦的擴散平板法進行[14]。實驗的10種常規(guī)抗生素采用市售藥敏紙片，將芽孢桿菌均勻分布于LB平板上(107CFU/mL)，攝取各種抗菌紙片，分別緊貼于培養(yǎng)基表面，置于37 ℃培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈的直徑。直徑大于15 mm為高敏，直徑15 mm以下為中敏，無抑菌環(huán)為不敏感。

1.6 菌種鑒定

采用表型特征結(jié)合16 S rRNA序列分析進行菌種鑒定[16]。按照提取細菌基因組的試劑盒說明書流程提取細菌DNA，經(jīng)過PCR擴增，測序，將最終得到的基因序列在NCBI上進行Blast比對分析，并將比對后的數(shù)據(jù)應用MEGA 5.0 軟件進行基因系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建和基因系統(tǒng)進化關(guān)系分析。

1.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0進行，每個實驗均重復3次，數(shù)據(jù)以平均值±標準偏差表示，并進行單因素方差分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽孢桿菌的分離與初步篩選

從5個健康仔豬糞便共分離得到225株芽孢桿菌，其中28株芽孢桿菌的芽孢生成率在90%以上，且它們的芽孢經(jīng)過80 ℃處理30分鐘后，萌發(fā)率在95%以上。選取產(chǎn)孢率超過90%的菌株進行后續(xù)研究。對初步分離獲得的28株芽孢桿菌在100 g/L蔗糖的LB培養(yǎng)基發(fā)酵，測定其胞外多糖含量，頻數(shù)分布如圖1所示。

圖1 芽孢桿菌胞外多糖產(chǎn)量頻數(shù)分布圖Fig.1 The frequency distribution of exopolysaccharide yield of isolated Bacillus strains

從圖1可知，芽孢桿菌胞外多糖產(chǎn)量差異明顯，其中胞外多糖產(chǎn)量在20 g/L以上的有4株，將這4株重新命名為JN1，JN2，JN3和JN4，進行下一步的胞外多糖抑制ETEC介導的血凝反應的能力評價。

2.2 芽孢桿菌胞外多糖對血凝反應的抑制作用

考察4株芽孢桿菌JN1，JN2，JN3和JN4胞外多糖對ETEC介導的血紅細胞血凝反應的抑制作用，如表1所示。芽孢桿菌JN4的胞外多糖在4 mg/mL時就能抑制血凝反應，而芽孢桿菌JN1和JN2的胞外多糖在8 mg/mL時能抑制血凝反應，都和商品甘露聚糖在12 mg/mL時才抑制血凝反應有明顯的差異(P<0.05)，但芽孢桿菌JN3的胞外多糖在實驗質(zhì)量濃度內(nèi)(12 mg/mL)都沒有抑制作用。不同芽孢桿菌胞外多糖對ETEC介導的血凝反應具有不同的抑制作用，可能和多糖的組成和結(jié)構(gòu)有關(guān)，不同的單糖組成和分子結(jié)構(gòu)與ETEC細胞表面蛋白的結(jié)合能力不同[15]。

表1 芽孢桿菌胞外多糖對血凝反應的抑制作用Table 1 The inhibition effects of exopolysaccharide fromBacillus on hemagglutination of porcine erythrocytesby enterotoxigenic Escherichia coli

注：“+”表示有抑制作用，“-”表示沒有抑制作用。

ETEC是一種常見的導致動物腹瀉的致病菌，它可以和腸道細胞的蛋白特異性結(jié)合，從而在腸道內(nèi)定殖，并迅速繁殖，產(chǎn)生腸毒素，進而導致腹瀉，嚴重時可導致死亡[16]。目前，由于商品的寡糖和多糖可以有效地和ETEC結(jié)合(抑制血凝反應)，而被應用于預防ETEC大腸桿菌病，但大部分寡糖和多糖的有效抑制濃度為16 mg/mL[17]。芽孢桿菌JN4胞外多糖在低濃度下(4 mg/mL)即可有效抑制ETEC介導的血凝反應，表明其具有非常重要的預防和治療ETEC大腸桿菌病的應用前景。更重要的是，益生菌雖然在預防和治療大腸桿菌病上具有較好的效果，但不同的菌株效果不同，因此，通過多糖對ETEC血凝性的抑制能力和多糖產(chǎn)量的綜合評價，可以用于定向篩選有效防治ETEC大腸桿菌病的益生菌。

2.3 芽孢桿菌胞及其芽孢的人工胃、腸液耐受能力

芽孢桿菌可以作為益生菌首先它需要耐受腸胃液的消化，才能在腸道定殖，形成有益代謝產(chǎn)物，考察芽孢桿菌JN4的人工胃液耐受能力如表2所示。從表2中可知，芽孢桿菌JN4的芽孢在人工胃液下具有很高的存活率，在pH 3和4處理3 h，芽孢的存活率超過89%，在pH 2處理條件下存活率也超過80%。然而，芽孢桿菌JN4營養(yǎng)體的人工胃液耐受能力很差，在pH 3和4處理3 h后，存活率僅在10%左右。

表2 芽孢桿菌JN4及其芽孢的人工胃液耐受能力Table 2 Effect of simulated gastric environment on thesurvival rates of Bacillus JN4

注：同列間標有不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

芽孢桿菌JN4的芽孢同樣具有很好的腸液耐受能力(圖2)，表明攝入的芽孢可以耐受動物的胃腸液，從而可能在腸道內(nèi)萌發(fā)、定殖。但是，芽孢桿菌JN4的營養(yǎng)體在人工腸液下的耐受能力較差，在人工腸液下2 h后僅有10%的營養(yǎng)體存活。因此，雖然研究證明芽孢桿菌可以在厭氧條件下生長、代謝，從而起到益生作用，但考慮到其營養(yǎng)體在較高膽鹽濃度下存活率較差，需要攝入足夠量的孢子才能起到有效的作用。

圖2 芽孢和營養(yǎng)體在人工腸液下的耐受性Fig.2 The tolerance of spores and vegetative cells toward simulated small intestinal juice

2.4 芽孢桿菌的抗生素敏感性

抗生素敏感性是益生菌使用是否能安全使用，不會產(chǎn)生耐藥性傳遞的重要指標，芽孢桿菌JN4對10中常見抗生素，包括青霉素、慶大霉素、卡那霉素、新霉素、四環(huán)素、紅霉素、氯霉素、萬古霉素、鏈霉素和環(huán)丙沙星的敏感性如表3所示。

表3 芽孢桿菌JN4的抗生素敏感性Table 3 Antibiotic susceptibility test of Bacillus JN4

注：*括號中的數(shù)值表示抗生素濃度(μg/L)；#括號中表示抗生素敏感程度，S：敏感；M：中度敏感。

由表3可知，芽孢桿菌JN4對大部分的抗生素敏感，僅對青霉素中度敏感。

2.5 芽孢桿菌JN4的鑒定

采用生理生化特性結(jié)合16 S rRNA分析對芽孢桿菌JN4進行鑒定，芽孢桿菌JN4具有很強的淀粉分解能力，菌體直徑小于1 μm，芽孢中生，在含有65 g/L NaCl的LB培養(yǎng)基上可以生長，具有酪蛋白和明膠分解能力。結(jié)合其16 S rRNA測序，并經(jīng)BLAST分析，鑒定其為解淀粉芽孢桿菌JN4，構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹如圖3所示。

圖3 芽孢桿菌JN4的系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on the 16 S rRNA amongBacillus JN4 and related strains

3 結(jié)論

分離獲得了1株高產(chǎn)胞外多糖的解淀粉芽孢桿菌JN4，其胞外多糖在4 mg/mL時就能抑制ETEC介導的血紅細胞凝集反應。體外實驗表明，解淀粉芽孢桿菌JN4的芽孢可以耐受人工腸胃液環(huán)境，且對常見的抗生素敏感，是理想的用于有效防治ETEC導致的大腸桿菌病的飼用益生菌。