東北酸菜不同發酵時間有機酸變化及其對產品酸感的影響

馬藝熒，孫波，張宇，郝宇，解雙瑜，李天一，劉東傲

(東北農業大學 食品學院，黑龍江 哈爾濱，150030)

東北酸菜以白菜為原料，利用乳酸菌發酵而成，是中國東北地區傳統發酵食品之一，因其口感脆嫩以及營養豐富等特點深受人們的喜愛[1]。近年來，東北酸菜從傳統手工作坊發展到利用大型發酵設備并采用直投乳酸菌規模化生產[2-3]。無論采用何種發酵方式，其發酵過程中都會產生除乳酸外多種有機酸[4]，這些有機酸具有不同的酸味特征，共同形成了東北酸菜獨特的酸感[5]。然而不同有機酸的組成與含量直接導致產品酸感的差異，并最終決定產品的口感及商品價值[6]。目前應用于東北酸菜的感官評價方法一般為定量描述分析、評分法[7-9]和模糊綜合評價法[10-11]，這些方法主要是通過色澤、氣味、酸度、脆度等方面對其進行評價，不能描述這些有機酸種類組成與含量比例不同導致產品酸感的微小差異。暫時性感官支配分析法(temporal dominance of sensations，TDS)的特點是能夠細致描述食品在品嘗過程中每種感官屬性隨時間的變化過程[12]。NG等[13]通過TDS等方法探討11種黑醋栗南瓜樣品成分對其味覺和風味感知的影響；MEILLON等[14]利用TDS描述不同脫醇葡萄酒口感的細微差異；此外TDS在乳制品、肉制品等產品的感官評價中也有許多應用[15-16]，而在東北酸菜中的應用尚未有人報道。

本研究主要研究東北酸菜不同發酵時間有機酸種類組成及含量比例變化規律并結合TDS對其酸感進行感官評價，旨在闡明有機酸種類組成及含量比例與酸感的相關性，為工業化生產東北酸菜并優化發酵工藝提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

用于發酵的新鮮白菜由中國黑龍江省農墾北安管理局紅星農場當地農民種植；植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)由東北農業大學食品學院保藏；乳酸、檸檬酸、乙酸、草酸、蘋果酸、琥珀酸、酒石酸、丙酸、戊酸：色譜純，天津市光復精細化工研究所；磷酸、甲醇：色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀(Waters Alliance 2695)，美國沃特世公司；高速離心機(Sigma 3-18K)，德國Sigma公司。

1.3 東北酸菜發酵生產工藝流程

白菜→挑選→入罐接種、加鹽水→密封→發酵→開罐取菜

工藝操作要點：將白菜原料進行挑選后通過輸送帶移入100 t發酵罐內，接種乳酸菌并打入鹽水后進行發酵。發酵控制條件：20 ℃、120 d。上述生產過程在北大荒親民有機食品有限公司完成。

1.4 樣品采集

在發酵過程中每隔30 d，即在發酵0、30、60、90、120 d時從發酵罐中收集樣品。值得注意的是，由于發酵罐體積過大，發酵罐不同位置發酵程度有差異，為保證每次取樣的一致性，建議在發酵罐同一部位取樣。

1.5 有機酸的測定

1.5.1 樣品前處理

東北酸菜樣品收集后打漿擠汁，然后10 000 r/min離心20 min，保留上層清液過0.45 μm水系濾膜后置于-4 ℃條件下待測。

1.5.2 色譜條件

色譜柱：Agilent C18(5 μm，250 mm×4.6 mm)；流動相：V(體積分數為0.1%的磷酸溶液)∶V(甲醇)=97.5∶2.5；紫外檢測波長：210 nm；進樣量：20 μL；流速：1.0 mL/min；柱溫：40 ℃。

1.6 感官評價

1.6.1 評價員培訓

按照GB/T 16291.1—2012《感官分析選拔、培訓與管理評價員一般導則》[17]建立感官評價小組，由20名具有感官評價經驗的評價員(10名男性，10名女性)組成。評價員的培訓參考CHARLES[18]和DINNELLA[19]等的方法，讓評價員了解TDS的評價過程并對優勢酸感的選擇進行培訓。

1.6.2 TDS評價過程

TDS的評價過程參考DINNELLA等[20]的方法，首先為評價員隨機提供發酵0、30、60、90、120 d的東北酸菜樣品，每份樣品需進行3次重復實驗。當指示小組成員開始進行評價時，評價員將樣品(約10 g)放入口中，開始計時，在品嘗90 s時計時結束。計時期間要求感官評價人員選擇最優勢的酸感并記錄出現時間。酸感描述詞分別為寡淡、柔和及尖酸。寡淡是指酸感較淡薄，不刺激；柔和是指各種酸感相互協調適中；尖酸是指酸感強烈、刺激。

1.6.3 TDS曲線的繪制

TDS數據的處理方法參考PINEAU[21]、MONACO[22]、GON?ALVES[23]和馬旭藝等[24]的方法，分別計算每個屬性在每個時間點的優勢率，即每個時間點選擇該屬性為最優勢感官的評價員人數與總評價員人數之比，如公式(1)所示[21]：

優勢率/%=

(1)

隨后以時間為橫坐標，酸感的優勢率為縱坐標繪制出平滑的TDS曲線，并在圖中加入2條線，1條為“偶然水平”線，曲線在該水平線以上表示某一酸感屬性可以被偶然感知，曲線在該水平線以下表示某一酸感屬性非優勢感官屬性。其值為P0，計算公式見式(2)[22]。另1條直線為“顯著水平”線，曲線在該水平線以上表示該屬性的優勢率顯著高于其他屬性，其值為PS，計算公式見式(3)[23]。

(2)

(3)

式中：P表示感官屬性的數量；Ps表示α=0.05時TDS曲線任意時間點的最小顯著P值；n表示實驗次數，即實驗人員×重復次數。

1.7 數據處理

采用SPSS 21.0數據處理軟件進行有機酸數據處理及相關性分析，有機酸結果用平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 不同發酵時間東北酸菜有機酸的變化

由表1可知，東北酸菜在發酵120 d過程中,能夠檢測到乳酸、檸檬酸、乙酸、草酸、蘋果酸、琥珀酸、酒石酸、丙酸及戊酸9種有機酸。發酵初始時只檢測到檸檬酸、草酸、琥珀酸這3種有機酸，隨著發酵時間的延長，這3種有機酸的含量也在增加。120 d達到最大，這表明白菜原料本身就含有一定量的有機酸，隨著發酵的進行乳酸菌和其他微生物進一步代謝產生這3種有機酸，導致其含量逐漸增加；發酵30 d時，除上述3種有機酸外還檢測到乳酸、乙酸、蘋果酸、酒石酸，這些有機酸含量也隨著發酵時間的延長而增加，其中乳酸含量增加幅度最大，這表明在采用直投乳酸菌劑進行發酵過程中，植物乳桿菌為優勢發酵菌群且產乳酸能力高[25]，因此乳酸為其主要代謝產物；其次為乙酸，這可能是由原料白菜中附著的天然醋酸菌或其他微生物產生[26]；蘋果酸、酒石酸增加幅度較小，這可能是由于乳酸菌一直為發酵優勢菌群，在發酵過程中產生大量乳酸，環境酸度升高抑制了相應的產酸微生物活動導致，因此它們對應產生的蘋果酸、酒石酸含量也較低；發酵120 d時,檢測到少量丙酸、戊酸，這可能是由于此時乳酸菌的活力逐漸降低，發酵環境中代謝產生丙酸、戊酸的微生物逐漸活躍。

表1 不同發酵時間東北酸菜有機酸的變化 單位：g/kg

注：“—”表示未檢出；同行不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

由表2可知，在發酵120 d過程中，東北酸菜中各種有機酸的比例發生明顯變化。其中乳酸占總有機酸的比例先增加后減小，在發酵90 d時達到最高，為62.14%，發酵120 d則下降至56.56%。這可能是由于發酵90 d時已積累的高濃度乳酸反而開始抑制乳酸菌代謝，同時相應的其他產酸微生物開始活躍；此外，乙酸占總有機酸比例逐漸增加，在發酵120 d時達到最高，為9.73%，這可能是由于一些更耐酸的產乙酸微生物可在發酵120 d內持續產生乙酸的原因；再有草酸、蘋果酸、琥珀酸、酒石酸占總有機酸的比例逐漸減小，這是因為這些有機酸含量隨發酵時間的延長增加幅度較小，而其他有機酸含量隨發酵時間的延長增加幅度較大，因而導致其占總有機酸比例逐漸減小；檸檬酸占有機酸的比例先減小后增加，在發酵60 d時最小。這可能是由于在0～60 d內產檸檬酸的微生物受到抑制，檸檬酸含量增加幅度較小；在60～120 d內其逐漸活躍，檸檬酸開始大量增加。

表2 不同發酵階段東北酸菜各有機酸占總有機酸比例 單位：%

2.2 不同發酵時間東北酸菜酸感的TDS評價

由圖1-a可知，發酵30 d樣品的唯一優勢酸感為寡淡，其最高優勢率在第22 s出現，為63%，寡淡作為優勢酸感的持續時間為73 s；柔和和尖酸2種酸感不顯著。這是由于在發酵30 d時乳酸菌活力較低，產乳酸量低，其他各種有機酸的含量也較低導致酸感強度低。因此，發酵30 d樣品的優勢酸感為寡淡。由圖1-b可知，發酵60 d樣品的唯一優勢酸感為寡淡，其最高優勢率在第52 s出現，為48.5 %，寡淡作為優勢酸感的持續時間為50 s；柔和和尖酸2種酸感不顯著。但與發酵30 d樣品相比，發酵60 d樣品寡淡的最高優勢率較低、出現時間較晚、持續時間短，且此時產品柔和酸感的優勢率有所升高，這是由于在發酵60 d相比于發酵30 d乳酸菌活力有所提高，其代謝產生有機酸的含量有所增加，尤其是乳酸含量增加較多，使得柔和酸感增加，但總有機酸含量較低，此時酸感仍表現為寡淡。由圖1-c可知，發酵90 d樣品優勢酸感為柔和，咀嚼后期變為寡淡。柔和的最高優勢率在第24 s出現，為60.3%，其作為優勢酸感的持續時間為26 s，這是由于在發酵90 d時乳酸比例最高，達到62.14%，其酸味柔和且有后酸味[27]，并在呈酸中起到主導作用。而其他有機酸則起到輔助作用，如檸檬酸酸味爽快、蘋果酸酸味溫和、琥珀酸有鮮味[28-29]，賦予產品柔和酸感；寡淡的最高優勢率在第90 s出現，為55.4%，其作為優勢酸感的持續時間為33 s，這是由于隨著品嘗時間增加酸感逐漸減弱導致的，并不是由于有機酸比例組成。由圖1-d可知，發酵120 d樣品主要優勢酸感為尖酸，其次為柔和，2者隨咀嚼時間順序出現。尖酸的最高優勢率在第21 s出現，為61.5%，其作為優勢酸感的持續時間為30 s，這是由于乙酸酸味刺激[30]，且含量及比例較高，再加上丙酸和戊酸的產生，丙酸本身也具有典型的乙酸味道[31]，使得尖酸感更加突出；柔和的最高優勢率在第62 s出現，為57.2%，其作為優勢酸感的持續時間為52 s，這是由于隨著品嘗時間的延長，強烈的尖酸感逐漸減弱；柔和和寡淡的優勢率隨咀嚼時間逐漸升高，但并不顯著，這可能是由于雖然隨著咀嚼時間的延長尖酸酸感逐漸減弱，但在咀嚼期間還未完全消失。

a-發酵30 d;b-發酵60 d;c-發酵90 d;d-發酵120 d圖1 不同發酵時間東北酸菜樣品TDS曲線Fig.1 TDS curves of Northeast sauerkraut samples at different fermentation time

從上述實驗結果看，東北酸菜發酵90 d與發酵30、60、120 d相比，不僅各有機酸含量以及比例組成比較合適，而且酸感柔和適中。

2.3 東北酸菜有機酸與酸感的相關性

由表3可知，寡淡與乳酸、檸檬酸、乙酸、草酸、蘋果酸、琥珀酸、酒石酸呈極顯著負相關性(P<0.01)，與丙酸、戊酸無相關性(P>0.05)；柔和與乳酸、檸檬酸、草酸、蘋果酸、琥珀酸、酒石酸呈極顯著相關性(P<0.01)，與乙酸呈顯著相關性(P<0.05)，與丙酸和戊酸無相關性(P>0.05)；尖酸與乳酸、檸檬酸、乙酸、琥珀酸、酒石酸、丙酸、戊酸呈極顯著相關性(P<0.01)，與草酸、蘋果酸呈顯著相關性(P<0.05)。綜上所述，乳酸、檸檬酸、乙酸、草酸、蘋果酸、琥珀酸及酒石酸含量對東北酸菜柔和酸感有促進作用，但含量過高容易導致產品產生尖酸酸感，丙酸與戊酸的存在會導致東北酸菜產生尖酸酸感。

表3 東北酸菜不同發酵時間的有機酸與酸感的相關性分析Table 3 Correlation analysis of organic acids and sour sense of Northeast sauerkraut at different fermentation time

注：“**”表示在0.01水平上顯著相關；“*”表示在0.05水平上顯著相關。

3 結論

本研究發現東北酸菜發酵過程中主要產生有機酸為乳酸，但同時也能產生檸檬酸、乙酸、草酸、蘋果酸、琥珀酸、酒石酸、丙酸、戊酸8種有機酸，這些有機酸共同形成了東北酸菜特有的酸感。不同發酵時間各有機酸的種類組成與含量比例不同，直接導致產品酸感不同。發酵90 d的樣品經HPLC檢測，總有機酸含量為11.999 g/kg；乳酸、檸檬酸、乙酸、草酸、蘋果酸、琥珀酸、酒石酸含量分別為7.456 g/kg、2.183 g/kg、0.784 g/kg、0.758 g/kg、0.525 g/kg、0.224 g/kg、0.068 g/kg；相應的所占比例分別為62.14%、15.46%、6.54%、6.32%、4.37%、1.87%、0.57%，丙酸和戊酸未檢出；通過TDS評價表明相比于其他發酵時間的樣品，發酵90 d時各有機酸含量及比例比較合適，而且酸感柔和適中，因此90 d為東北酸菜最適發酵期。乳酸在東北酸菜酸感形成中起到主導作用，檸檬酸、乙酸、草酸、蘋果酸、琥珀酸及酒石酸則起到輔助作用。同時通過相關性分析表明這些有機酸含量及比例合適時對東北酸菜柔和酸感起到促進作用，但含量及比例不合適時會破壞柔和酸感；丙酸和戊酸的存在則會導致尖酸酸感。上述研究結論將有助于通過東北酸菜發酵工藝精準控制有機酸形成，進而通過控制東北酸菜的酸感有效提高產品質量。