霉菌純種制曲豆豉在傳統后發酵中的成分變化及其與生物胺相關性的研究

劉敏，張仁鳳，陳光靜，宋軍，闞建全,3,4*

1(西南大學 食品科學學院，重慶,400715) 2(菽鄉(重慶)農業科技有限責任公司，重慶,400715) 3(中匈食品科學合作研究中心，重慶,400715) 4(農業部農產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室(重慶)，重慶,400715)

豆豉是以黃豆或大豆為主要原料，利用曲霉、毛霉或者細菌制曲產生的復雜酶系分解大豆中營養物質，發酵而成的一種傳統豆制品[1]，根據制曲時微生物不同分為細菌型、米曲霉型、毛霉型和根霉型豆豉等[2]。豆豉的制作主要有原料預處理、制曲、后發酵3個階段。在實際生產中后發酵分為2種類型：一種是制曲拌料后的豆豉坯放入大窖池或大陶缸或塑料大袋中密封在室溫下后熟，時間大約8個月及以上，是企業常用的后熟方式，稱為“傳統后發酵”或“傳統后熟”[3]，大多為毛霉型豆豉；一種是制曲拌料后，將豆豉坯放入大陶缸或塑料大袋中在較高溫度水浴或室內溫度(40～60 ℃)下后熟，時間大約20～40 d，是現在部分企業采用的后熟方式，也將是發展的趨勢，稱之為“快速后發酵”或“快速后熟”，主要為米曲霉型豆豉。

生物胺(biogenic amines，BA)是一類具有生物活性的低分子含氮有機化合物的總稱，在食品中主要由氨基酸經脫羧酶催化脫羧反應產生。發酵豆豉滿足BA產生的3個條件：存在分泌氨基酸脫羧酶的微生物；存在對應氨基酸；存在有利于微生物生長且有助于分泌氨基酸脫羧酶的環境條件[4-7]。目前大多數企業仍然是利用多年形成優勢菌群的曲房，采用自然接種方式制曲，微生物區系較復雜，造成產品中生物胺的含量較高且不穩定，不同企業和同一企業不同批次產品中BA的含量也有較大的差異。研究發現，不同的制曲方式和發酵形式會影響豆豉中BA的類型和含量[8-9]。游離氨基酸大量存在于豆豉中，所以控制豆豉中生物胺含量的關鍵在于控制豆豉發酵過程中能夠產生生物胺的微生物的種類和數量，而有關純種制曲能否達到控制豆豉中生物胺含量的研究報道很少。

本課題組前期檢測出總狀毛霉、雅致放射毛霉、五通橋毛霉、米曲霉2339、米曲霉41380、米曲霉40188 這6株試驗菌株均產生酪胺，雅致放射毛霉和3株米曲霉能產生色胺，3株米曲霉能產生腐胺，而僅總狀毛霉具有組氨酸脫羧酶活性[10]。可見，霉菌產生物胺的種類和含量無種屬特異性，但有菌株特異性，即同一種屬不同菌株產生物胺的能力各不相同，這還需要通過實際生產來進一步驗證說明。根據文獻報道，永川毛霉型豆豉制曲中常用到的是總狀毛霉[11]，永川曲霉型豆豉制曲中常用的是米曲霉滬釀3.042(AspergillusoryzaeCICC 2339),具有生長快、產孢子量大、酶系豐富的特點[12]。因此，本實驗擬采用目前工業生產中最常見的總狀毛霉(MucorracemosusCICC 40481)和米曲霉滬釀3.042進行純種制曲，采用“傳統后發酵”方式，研究其發酵中的動態變化及與生物胺的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料

黃豆(東北大豆)：購自永輝超市。

發酵菌種：總狀毛霉(MucorracemosusCICC 40481)和米曲霉滬釀3.042(AspergillusoryzaeCICC 2339)，均購買于中國工業微生物菌株保藏管理中心(CICC)。

1.1.2 主要試劑

BA標準品(純度均在98%以上)：腐胺、尸胺、精胺、亞精胺、色胺、2-苯乙胺、組胺、酪胺，美國Sigma公司；苯甲酰氯，SIGMA公司；5’-磷酸吡哆醛、磷酸纖維素粉、二硫蘇糖醇、氨基胍硫酸鹽、L-組氨酸、L-酪氨酸、L-賴氨酸、L-精氨酸、L-鳥氨酸、L-賴氨酸、L-苯丙氨酸：分析純，BIOSHARP公司；甲醛(分析純)、甲醇(色譜級)，成都科龍化工試劑廠提供。

1.2 主要儀器與設備

高效液相色譜儀(Agilent 1260)，美國Agilent公司；氨基酸自動分析儀(L-8900)，日立(HITACHI)；臺式高速離心機(5810)，德國Eppendorf公司；電子天平(SQP)，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；pH計(PB-10)，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；可調式氮吹儀(PGC-21D)，京中諾遠東公司；微型漩渦混合儀(MX-F)，上海瀘西分析儀器有限公司；生化培養箱(LRH-150F)，上海齊欣科學儀器有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱(DCX-9243 B-1)，上海一恒科學儀器有限公司；數控超聲波清洗器(KQ 3200DB)，昆山市超聲儀器有限公司；可調高速勻漿機(FS-2)，江蘇金壇科析儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 豆豉純種發酵的基本工藝流程

1.3.2 操作要點

(1)菌種培養：菌種在PDA培養基[13](馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃高壓滅菌20 min)試管中分別接種，28 ℃恒溫箱培養3 d左右。選取菌體生長良好的試管斜面，向試管中加入1 mL無菌水，振搖洗下培養基菌絲上的孢子，將制好的孢子懸液與麩皮培養基(麩皮與水質量比1∶1混合，121 ℃高壓滅菌15 min)混合均勻，在三角瓶中于28 ℃下培養3 d，進行擴大培養，為防止培養基結塊，每隔5～6 h扣瓶1次。

(2)大豆篩選：選擇成熟充分、顆粒飽滿均勻、無霉爛變質的黃豆。

(3)浸泡：大豆在40 ℃水中浸泡150 min，使大豆吸收一定水分至50%左右。

(4)蒸煮：常壓下2 h或0.14 MPa下蒸煮20～30 min。判斷標準：大豆外觀呈黃褐色，有豆香味，松散、柔軟、無硬心、不黏、無浮水。

(5)冷卻：室溫下冷卻至32 ℃。

(6)接種：接種量按大豆質量的0.3%～0.5%計，把三角瓶中的種子菌與黃豆充分拌均勻。

(7)制曲：米曲霉28 ℃，3 d；毛霉15 ℃，5 d。

(8)拌料：按曲坯質量計，在制好的曲料中拌入3%白酒(其酒精體積分數為52%)、3%醪糟和12%食鹽，拌和均勻。

(9)傳統后發酵：將拌料后的曲料分裝至密封袋中，置于室溫下發酵。

(10)對照組的操作：篩選的大豆經過浸泡、蒸煮、冷卻后，不接種任何菌種，按料的質量計，在其中拌入3%白酒(其酒精體積分數為52%)、3%醪糟和12%食鹽，拌和均勻。

1.3.3 待測豆豉樣品的制備

S1～S7是樣品的制曲階段， S8～S18分別代表了豆豉樣品在后發酵階段，詳見表1。

表1 后發酵階段Table 1 Stage of tradition post-fermentation

在S8～S18分別取樣，經充分研磨后，進行水分、總酸、pH值、氨基酸態氮、游離氨基酸、氨基酸脫羧酶活性及BA種類和含量的測定，并做3次平行試驗。DZ表示對照組，MQ表示滬釀3.042組，ZZ表示總狀毛霉組。

1.4 檢測指標

1.4.1 水分含量

采用GB/T 5009.3—2016《食品中水分的測定》[14]直接干燥法進行測定。

1.4.2 pH值

取5.0 g待測樣品(含水量約45%)于50 mL離心管中，加20 mL蒸餾水并用勻漿機分散均勻，8 000 r/min離心15 min，將上清液轉移至50 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至50 mL，用pH計測量上述定容溶液的pH值。

1.4.3 總酸

采用GB 12456—2008[15]《食品中總酸的測定》中的酸堿滴定法。

1.4.4 氨基酸態氮

采用GB 5009.235—2016[16]《食品中氨基酸態氮的測定》中的酸度計法進行測定。

1.4.5 游離氨基酸

采用氨基酸自動分析儀法[17]測定。準確稱取豆豉樣品200 mg于10 mL塑料離心管中，加入2 mL 4%磺基水楊酸溶液，漩渦振蕩混勻，于4 ℃靜置15 h后，8 000 r/min離心10 min。取上清液過0.45 μm濾膜后上機分析測定。分析條件為：進樣量20 μL；泵1流速0.4 mL/min；泵2流速0.35 mL/min；柱溫70 ℃；反應器溫度135 ℃。

1.4.6 氨基酸脫羧酶活力的測定

參考ENDO的方法[18]。在37 ℃下，每1 h催化產生1 μmol BA的酶量，為1個活力單位(U)，氨基酸脫羧酶活性用1 g豆豉所具有的活力單位(U/g)來表示。

1.4.7 BA的檢測

參考胡鵬的方法[19]進行樣品預處理，參照國標GB/T 5009.208—2008《食品中生物胺含量的測定》[20]制備BA標準溶液，參考LIU等[21]的方法進行BA測定的柱前衍生，參考并改進SHUKLA的分析條件[22]進行液相色譜，色譜柱：Agilent XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相A和B：超純水和甲醇；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL；紫外檢測波長：254 nm；柱溫：30℃。進行梯度洗脫，洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program

1.5 數據處理

試驗數據采用Excel 2010、SPSS 17.0和Origin 8.6進行統計分析處理和作圖，所有實驗均重復 3次，數據為平均值±標準差。樣品中總酸、氨基酸、氨基酸態氮、生物胺的含量和氨基酸脫羧酶活性的數據都是標準化后統一到樣品水分含量為45%時的數據。

2 結果與分析

2.1 霉菌純種制曲豆豉在后發酵過程中有關成分的變化

由圖1-a可知，DZ(對照)組、MQ(米曲霉)組和ZZ(總狀毛霉)組的豆豉在S8-S18過程中水分含量變化較小，說明后發酵對水分含量的影響很小，而MQ與ZZ的水分差異應該與它們在后發酵過程中的消耗水分以及生物熱差異有關[23]。由圖1-b和圖1-c可知，在豆豉傳統后發酵(S8-S18)過程中，各組pH值均呈現下降的趨勢，且下降幅度MQ>ZZ>DZ；同時，MQ組和ZZ組的總酸含量逐漸增加(MQ>ZZ)，當傳統后發酵進行到末期，尤其是到達S17～S18時，pH值和總酸值波動較小。這是由于在后發酵剛開始時，依靠制曲期積累的酶的作用，將豆豉中的碳水化合物和脂肪以及蛋白質分解成有機酸、脂肪酸及氨基酸，從而使總酸含量快速増加，pH值快速下降。而隨著發酵時間進一步地延長，發酵環境條件的改變，酶的催化反應減弱，同時體系內部的一些酸與醇類發生酯化反應合成酯類，消耗部分酸使得總酸的含量趨于穩定、pH值下降緩慢直到穩定[24]。而與MQ組和ZZ組相比，DZ組由于沒有接種微生物進行制曲，體系內各種酶的數量較少，因此總酸含量增長較為緩慢。3組樣品總酸值均小于2.5 g/100 g(以乳酸計)，符合國家標準。

在后發酵階段，在微生物所分泌的蛋白酶等酶系作用下，蛋白質水解成氨基酸和多肽，生成小分子肽、氨基酸及各種香氣的前體物質，因此氨基酸態氮含量能反映出蛋白質的水解程度。由圖1-d可知，在S8-S18階段，各組氨基酸態氮含量順序為MQ>ZZ>DZ，這與豆豉發酵中MQ和ZZ產酶特性有關[24-25]，MQ生長和產酶的適宜條件為6.5～6.8，可產生酸性、中性、堿性蛋白酶。MQ組和ZZ組的氨基酸態氮含量在后發酵開始的前30天(S8～S11)逐漸增加而后趨于平緩，這主要是由于后發酵前期各種酶活性都較高，但隨著后發酵的進行，產生的有機酸增加，蛋白酶酶活力降低，導致氨基酸態氮的生成速率降低[26-27]。

圖1 霉菌純種制曲豆豉在傳統后發酵過程中水分含量(a)、pH值(b)、總酸(c)和氨基酸態氮含量(d)變化Fig.1 The changes of water content (a), pH (b) and total acid (c), amino acid nitrogen content (d)of mold starter-making Douchi during traditional post-fermentation

2.2 霉菌純種制曲豆豉在后發酵過程中與BA相關的游離氨基酸的變化

游離氨基酸是BA形成的必備條件之一，在發酵過程中，蛋白質在蛋白酶的作用下最終水解為游離氨基酸，游離氨基酸的生成大大提高了蛋白質的消化率[28]。由表3可知，DZ組未接種微生物，該組的與BA相關的游離氨基酸含量隨時間延長呈現出下降趨勢。而MQ組和ZZ組豆豉在后發酵中與BA相關的游離氨基酸含量普遍呈現出先快速增加，之后有所下降，這與王雪蒙等[29]的結果類似。這是由于后發酵初期在制曲階段積累的蛋白酶、水解酶等的活性較高，蛋白質迅速水解促使游離氨基酸含量快速增加。隨著后發酵的進行，MQ和ZZ在高滲透壓下無法產生大量蛋白酶，同時酸環境也導致水解蛋白質的蛋白酶活力減弱[30]，因此游離氨基酸的生成速率降低，而發酵過程中BA生成以及美拉德反應[31]都會消耗部分氨基酸，當氨基酸的消耗速率大于生成速率時，豆豉中的游離氨基酸含量就減少了。

表3 霉菌純種制曲豆豉在傳統后發酵中游離氨基酸含量的變化Table 3 The changes of free amino acid content of mold starter-making Douchi duringtraditional post-fermentation

續表3

菌種組別編號游離氨基酸/(mg·kg-1)賴氨酸苯丙氨酸精氨酸組氨酸酪氨酸MQS82 198.80±12.21d2 870.63±20.99bc3 613.22±15.43d1 024.86±10.56c2 342.78±14.4fS92 850.53±22.39c3 958.65±12.31a4 013.59±18.60c1 453.02±9.73ab3 519.92±23.67dS102 775.64±22.98c3 944.19±22.00a5 639.43±19.45b1 354.42±10.22b3 685.42±14.49dS112 846.81±23.00c2 400.29±22.89c5 916.22±17.32a1 443.36±11.78ab3 020.07±14.22eS124 547.21±30.98a2 959.20±17.900b5 970.22±22.50a1 546.71±22.95a3 226.00±12.09eS134 547.19±29.52a3 022.26±19.22b6 077.96±23.94a1 498.36±12.43ab4 103.65±17.92cS144 345.50±29.87ab3 187.96±14.49b5 814.90±30.60ab1 311.91±14.33b3 216.25±15.98eS154 191.89±25.79b3 257.16±23.67b5 648.86±22.23b1 211.79±10.89bc4 439.60±22.69bS164 125.58±24.66b3 100.92±20.99b5 583.72±21.78b1 185.26±23.67c4 509.84±21.37aS174 181.67±25.12b3 090.01±15.67b5 680.20±26.99b1 111.96±10.09c4 190.60±33.25cS184 097.55±23.67b2 681.55±18.557c5 566.01±20.87b1 079.92±13.78c4 883.40±30.79aZZS8114.49±6.67f717.23±6.22d195.31±6.36f97.64±4.78e489.39±11.79fS9466.36±5.31e1 388.18±8.69b802.95±6.27e264.10±8.69d881.78±6.73eS101 158.69±10.49d1 930.60±8.55a1 773.30±10.68d428.11±8.11c1 237.53±9.42dS111 272.09±10.98d1 474.13±5.67b2 573.54±9.31c432.46±8.11bc928.08±11.35eS121 518.15±11.67c1 052.07±7.90c2 995.33±11.72a440.76±3.67bc923.51±10.31eS131 860.77±13.67a.1 965.34±11.38a3 165.96±16.89a566.22±8.66a1 359.84±12.89cS141 823.88±15.32a1 589.86±15.77b3 042.10±20.51ab547.57±5.77a1 547.93±13.73cS151 767.38±8.99bc2 167.06±18.26a2 732.87±22.98b533.68±5.59a2 221.82±15.42aS161 768.07±6.90bc2 032.05±10.58a2 761.04±14.78b454.08±5.81b1 077.35±10.56eS171 690.86±12.31c2 063.94±11.79a2 816.51±18.94b469.70±6.37b1 754.02±12.24bS181 742.56±13.57bc1 958.50±7.34a2 770.87±17.95b464.40±9.21b1 247.50±16.40d

注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

2.3 霉菌純種制曲豆豉在后發酵過程中與BA相關的氨基酸脫羧酶活力的變化

由表4可知，由于原料大豆在預處理時經過蒸煮，同時未接種微生物，無氨基酸脫羧酶產生，所以DZ組豆豉在整個后發酵階段均未檢測出氨基酸脫羧酶活力。MQ組豆豉在后發酵過程中檢測到鳥氨酸脫羧酶和苯丙氨酸脫羧酶活力，而ZZ組豆豉檢測出鳥氨酸脫羧酶和酪氨酸脫羧酶活力，但其中鳥氨酸脫羧酶酶活變化較小(0.21～0.40 U/g)且低于MQ。這暗示了MQ組具有較強的腐胺與2-苯乙胺合成能力，而ZZ組具有腐胺和酪胺合成能力。結合表3，MQ，ZZ組的氨基酸在S8～S18期間先增加后減少，這應該是蛋白質水解生成氨基酸、氨基酸脫羧酶分解氨基酸、氨基酸參與色澤生成反應3者共同作用的結果。

表4 霉菌純種制曲豆豉在傳統后發酵過程中氨基酸脫羧酶活力的變化Table 4 The changes of amino acid decarboxylase activity of mold starter-making Douchi with duringtraditional post-fermentation

續表4

菌種組別編號氨基酸脫羧酶活力/(U·g-1)鳥氨酸脫羧酶賴氨酸脫羧酶色氨酸脫羧酶苯丙氨酸脫羧酶組氨酸脫羧酶酪氨酸脫羧酶ZZS80.33±0.01bNDNDNDNDNDS90.31±0.02bNDNDNDND0.27±0.02cS100.40±0.01aNDNDNDND0.49±0.02aS110.37±0.01aNDNDNDNDNDS120.31±0.01bNDNDNDNDNDS130.33±0.00bNDNDNDNDNDS140.25±0.00dNDNDNDNDNDS150.30±0.00bcNDNDNDNDNDS160.29±0.01cNDNDNDND0.23±0.01dS170.21±0.01eNDNDNDND0.30±0.03bS180.24±0.02dNDNDNDND0.28±0.02bc

注：ND表示未檢出，下表同。

2.4 霉菌純種制曲豆豉在后發酵過程中的BA變化

圖2是BA混合標準品溶液的液相色譜圖，各BA的回歸方程及相關系數見表5，MQ、ZZ純種制曲的豆豉在傳統后發酵過程中生物胺的變化見表6。

圖2 生物胺混合標準品溶液的液相色譜圖Fig.2 The liquid chromatogram of biogenic amines mixed standard solution

表5 標準曲線的線性方程與相關系數Table 5 Linear equation and correlation coefficient ofthe standard curve

生物胺回歸方程相關系數R2線性范圍/(μg·L-1)保留時間/min腐胺y=101.45x+114.930.997 40.50～80.06.018尸胺y=70.003x+61.3110.998 50.50～80.06.875色胺y=52.319x+139.90.998 90.50～80.08.2212-苯乙胺y=51.88x+43.7240.999 30.50～80.09.601亞精胺y=69.215x+73.7830.996 10.50～80.010.249精胺y=72.624x+45.6210.998 40.50～80.013.523組胺y=24.692x-20.6640.997 30.50～80.014.990酪胺y=40.771x+92.0620.997 90.50～80.017.592

原料大豆DZ組未經制曲階段，在整個后發酵過程中仍含腐胺、尸胺、亞精胺和精胺4種BA，和本文類似，QIU等[32]在煮熟的豆漿、豆腐中也發現了生物胺；KALAC等[33]發現大豆中含有較高的精胺和亞精胺。MQ組豆豉在傳統后發酵前期含腐胺、2-苯乙胺、亞精胺和精胺，但隨著后發酵時間的延長，僅檢測出腐胺和2-苯乙胺2種BA；整個后發酵過程中，其腐胺含量變化不大(46.10～57.73 mg/kg)，而2-苯乙胺含量由ND增加到222.04 mg/kg，已超過歐盟規定的2-苯乙胺限量標準(2-苯乙胺<30 mg/kg)[34]；ZZ組豆豉在傳統后發酵過程中含腐胺、亞精胺和酪胺3種BA，其中腐胺含量變化較小(8.35～11.63 mg/kg)，亞精胺逐漸減少，而酪胺則呈逐漸增加的趨勢，這可能與BA的代謝中存在BA之間的相互轉換有關，例如腐胺、亞精胺和精胺這3種BA就可以互相轉換[35]。表6中MQ組的2-苯丙胺、ZZ組的酪胺增加也與表4檢測出的MQ組的苯丙氨酸脫羧酶活力、ZZ組的酪氨酸脫羧酶活力有關。

表6 霉菌純種制曲豆豉在傳統后發酵過程中生物胺的變化Table 6 The changes of biogenic amines of mold starter-making Douchi during traditional post-fermentation

續表6

菌種組別編號生物胺/(mg·kg-1)PUTCADPHESPDSPMHISTYRTBAMQS1352.36±1.69bND144.35±6.78bNDNDNDND196.71±7.99cS1449.89±2.35cND214.75±2.83aND4.31±0.29aNDND268.95±4.89abS1557.73±0.83aND222.04±8.54aNDNDNDND279.77±7.96aS1651.04±0.89bND219.09±1.84a0.53±0.11b1.93±0.06cNDND272.59±6.90aS1748.32±0.31cND209.42±8.98aNDNDNDND257.74±3.56bS1846.10±0.86cND207.70±11.21aNDNDNDND253.80±10.66bZZS811.51±0.46aNDND5.29±0.23cNDNDND16.80±1.35eS910.92±0.30abNDND7.87±0.28bNDND15.22±0.47d34.01±3.65dS1011.63±0.27aNDND9.17±0.35aNDND19.76±0.72c40.56±4.89cS1110.48±0.51bNDND9.76±0.13aNDND16.75±0.31d36.99±3.89dS1211.56±0.17aNDND2.82±0.20dNDNDND14.38±2.77fS1310.33±0.27bNDND2.91±0.27dNDNDND13.24±1.28fS148.77±0.12cNDND2.41±0.31dNDNDND11.18±0.98fS1511.10±0.05aNDNDNDNDNDND11.10±2.11fS1610.73±0.41bNDNDNDNDND27.15±3.96c37.88±3.46dS178.90±0.00cNDND1.72±0.13eNDND45.39±2.13b56.01±4.55bS188.35±0.14cNDND1.95±0.25eNDND63.68±4.76a73.98±4.98a

注： CAD：尸胺； HIS：組胺； PHE：苯乙胺；PUT：腐胺； TRP：色胺；SPM：精胺；SPD：亞精胺； TYR：酪胺；TBA：總生物胺，下圖同。

由圖3可以看出，通過S8和S18對比，DZ組的BA種類未發生變化，總生物胺(total biogenic amine, TBA)含量只降低了5.53%(表6)；MQ組的BA種類由S8的腐胺、亞精胺和精胺，變為S18的腐胺和2-苯乙胺，TBA含量增加了3.05倍(表6)；ZZ組的BA種類也發生變化，S18與S8的腐胺、亞精胺相比，新增加了酪胺，其TBA含量增加了3.40倍。MQ的TBA隨時間延長不斷累積增加，ZZ組的BA含量隨發酵進行先增加后降低再增加，整個后發酵過程中ZZ的TBA遠小于MQ，說明采用ZZ進行純種制曲在傳統后發酵要優于MQ；此外，調整后發酵時間也能達到控制BA目的。從表3來看，MQ組在各時間段的游離氨基酸含量均遠高于DZ和ZZ，從側面說明米曲霉發酵豆豉時產生水解蛋白質的酶系豐富或者產酶量更大，給生物胺合成提供更多的反應物，導致了豆豉中更高的生物胺含量，從表4看出，MQ檢測出的氨基酸脫羧酶活力也明顯高于ZZ，說明MQ的生物胺合成能力更強。這結果與豆豉實際生產的“毛霉型豆豉常是傳統后發酵方式，米曲霉豆豉常是快速后發酵方式”是一致的。

圖3 霉菌純種制曲豆豉傳統后發酵始末生物胺含量的對比Fig.3 Comparison of biogenic amines of mold starter-making Douchi during traditional post-fermentation

2.5 霉菌純種制曲豆豉在后發酵過程中與BA相關的游離氨基酸與BA含量間的相關性分析

圖4 霉菌純種制曲豆豉在傳統后發酵過程中與BA相關的游離氨基酸與生物胺含量間的相關性分析Fig.4 Relativity analysis between free amino acid and biogenic amine content of mold starter-making Douchi during traditional post-fermentation

表7 霉菌純種制曲豆豉在傳統后發酵過程中各參數的相關性(R)矩陣表Table 7 Correlation of parameters of mold starter-making Douchi during traditional post-fermentation process

組別水分pH值總酸氨基酸態氮PUTCADSPDSPMTBADZ水分1-0.1720.1800.0550.197-0.1570.2750.3480.254pH值1-0.965??-0.879??0.1600.868??-0.098-0.0080.185總酸10.926??-0.168-0.893??0.022-0.052-0.254氨基酸態氮1-0.219-0.829??-0.170-0.179-0.397PUT10.3900.2570.6010.601CAD10.1590.3430.508SPD10.723?0.877??SPM10.892??TBA1水分pH值總酸氨基酸態氮PUTPHESPDSPMTBAMQ水分10.432-0.365-0.3700.310-0.4500.4360.342-0.438pH值1-0.932??-0.904??0.175-0.986??0.831??0.832??-0.979??總酸10.884??0.0690.935??-0.777??-0.786??0.942??氨基酸態氮1-0.0340.871??-0.603?-0.621?0.882??PUT1-0.0890.0250.084-0.049PHE1-0.855??-0.836??0.998??SPD10.889??-0.829??SPM1-0.813??TBA1水分pH值總酸氨基酸態氮PUTSPDTYRTBAZZ水分1-0.5390.4650.579-0.077-0.2000.1870.146pH值1-0.972??-0.940??0.651?0.797??-0.505-0.302總酸10.964??-0.613?-0.822??0.4170.171氨基酸態氮1-0.642?-0.678?-0.5050.274PUT10.362-0.623?-0.511SPD1-0.1850.076TYR10.945??TBA1

注：** 表示在0.01水平上呈極顯著性相關，*表示0.05水平上呈顯著性相關。

根據相關系數的絕對值|r|的大小可以將相關關系大致分為5類：0.8～1.0為極強相關，0.6～0.8為強相關，0.4～0.6為中等程度相關，0.2～0.4為弱相關，0.0～0.2則可以視為極弱相關或無相關[36]。由圖4可知，苯丙氨酸含量和2-苯乙胺含量間為弱相關性，而精氨酸含量與亞精胺呈強的負相關(皮爾遜系數r分別為-0.770 9，P<0.01)，精氨酸含量與精胺含量呈極顯著負相關(皮爾遜系數r為-0.947 8，P<0.01)，腐胺與鳥氨酸之間的相關性由于鳥氨酸的未檢出而無法確定。

2.6 霉菌純種制曲豆豉在后發酵過程中有關成分與BA的相關性分析

對純種制曲豆豉在傳統后發酵過程中的水分含量、pH值、總酸和氨基酸態氮含量與BA含量進行相關性分析，結果如表7所示。豆豉在傳統后發酵期間水分含量變化很小，3組豆豉水分含量與各BA間無相關性。MQ組中，pH值與精胺和亞精胺呈極顯著正相關(P<0.01)，ZZ組中，pH值與腐胺有顯著正相關關系(P<0.01)、與亞精胺有極顯著正相關關系(P<0.01)；總酸含量/BA的相關性與pH值/BA相關性恰好相反。這表明在一定的酸性環境中(pH 5.5～6.6)，低pH(總酸含量高)對MQ、ZZ產生這些BA具有抑制作用，這可能是因為低pH值(總酸含量高)在一定程度上影響了菌的活性，這與吳燕燕等[37]的研究結果類似。大多數研究表明氨基酸態氮與BA之間呈現一定的正相關關系[38-39]，表7顯示在MQ組中，氨基酸態氮含量TBA呈極顯著正相關(P<0.01)，但在ZZ組中，氨基酸態氮含量與TBA的相關性不顯著。

3 結論

在傳統后發酵過程中，各試驗組豆豉水分含量均基本保持不變；總酸、氨基酸態氮、相關游離氨基酸含量先增加后穩定，而pH值先迅速下降后穩定。

對照組豆豉檢出腐胺、尸胺、亞精胺和精胺4種生物胺，且保持穩定；米曲霉組豆豉最終檢出腐胺和2-苯乙胺，總狀毛霉組豆豉最終檢出了腐胺、亞精胺和酪胺。米曲霉組和總狀毛霉分別具有苯丙氨酸脫羧酶、酪氨酸脫羧酶活力，二者都有鳥氨酸脫羧酶活力。

傳統后發酵過程中，水分與生物胺之間無相關性；而pH值和總酸與腐胺、亞精胺、精胺、總生物胺存在顯著相關性(P<0.05)；僅有米曲霉組豆豉的氨基酸態氮含量與總生物胺呈極顯著正相關(P<0.01)。精氨酸與亞精胺、精胺都出現了極顯著相關(P<0.01)，而苯丙氨酸含量和2-苯乙胺含量間為弱相關性。