反應條件對牛血清白蛋白-葡萄糖體系糖基化產物形成的影響

李軍，涂宗財,2*，沙小梅，張露，葉云花，羅娟，楊萍，邵艷紅

1(江西師范大學 生命科學學院，江西 南昌,330022) 2(食品科學與技術國家重點實驗室(南昌大學)，江西 南昌,330047)

美拉德反應(maillard reaction，MR)又稱為非酶褐變反應，是指含氨基化合物(氨基酸、蛋白質)和含羰基化合物(還原糖、醛)之間發生的復雜反應[1]，該反應在蛋白質和還原糖之間自發進行，無需添加任何化學物質。相對化學改性和酶法改性而言，基于MR機理的糖基化改性是食品蛋白質改性的一種綠色、有效的方法，已被人們廣泛應用于食品加工領域，成為食品科學領域的研究熱點之一。高蛋白和高糖類食品在熱加工過程中發生的糖基化反應可以促進食品風味物質的產生，增加口感，賦予食品色澤，增加美觀程度[2]，還能提高蛋白質的抗氧化活性等性質[3]。但當糖基化反應處于中期和晚期階段時，還原酮、醛和雜環化合物等一系列有害的糖基化產物也會隨之產生，進而對人體健康造成不良的影響。如DAGLIA等[4]研究發現羰基化合物可以造成細胞損傷，進而導致糖尿病及人體衰老；SACHSE等[5]研究發現，5-羥甲基糠醛具有致癌作用；張娟等[6]研究發現，高劑量的丙烯酰胺對雄性小鼠的睪丸細胞DNA有損傷作用；孫緬恩等[7]研究發現，食用過多含后期糖基化末端終產物(advanced glycation end products，AGEs)的食品可加速人體衰老，增加糖尿病、動脈粥樣硬化和阿爾茨海默癥等各種慢性退化疾病的發病率。因此，通過控制糖基化反應條件，降低食品加工過程中有害糖基化產物的形成具有重要的意義。

牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)是一種簡單的球蛋白，其作為牛血清中的主要成分，在食品、醫藥和生化領域中均有廣泛的應用。它作為動物來源的一種代表性蛋白，已經成為研究生物學功能、蛋白質理化性質、蛋白質與小分子相互作用等方面的一種理想蛋白模型。因此，本文以BSA-葡萄糖體系為簡單模型來研究糖基化體系在熱加工過程中糖基化產物形成的變化，研究反應時間和溫度的變化對糖基化產物，尤其是有害糖基化產物形成的影響，為食品熱加工過程中糖基化產物形成的調控提供一定科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、葡萄糖：分析純，美國Sigma公司；糖化血清蛋白(GSP)測定試劑盒(果糖胺法)，南京建成生物工程研究所；5-羥甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural，HMF)、丙烯酰胺：色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；2,4-二硝基苯肼(2,4-dinitrophenylhydrazine，DNPH)、三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)、異硫氰酸胍、鹽酸等：分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

納米超高壓均質機(NCJJ-0.007/200)，廊坊通用機械制造有限公司；酶標儀(Synergy H1)，美國Bio Tek公司；熒光分光光度儀(F-7000型)，日本日立公司；冷凍干燥機(LGJ-1D-80)，北京亞泰科隆儀器技術有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱(DHG-9023A)，上海精宏實驗設備有限公司；電子分析天平(FA1104N型)，上海丙林電子科技有限公司；Infinity Quaternary LC(Agilent 1260)，美國安捷倫公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品的制備

參照LIU等[8]的方法制備BSA-葡萄糖糖基化樣品。將BSA溶解于磷酸緩沖液(20 mmol/L，pH 7.4)中配成25 g/L的溶液，按照葡萄糖與蛋白質質量比為1∶1的比例向BSA溶液加入葡萄糖，混勻，凍干。將凍干的粉末置于恒溫烘箱中55 ℃下分別反應6、12、24、36、48、72 h，或分別于50、60、70、80、90、100 ℃下反應12 h。烘箱內的相對反應濕度均為65%(飽和KI溶液)。待反應結束后，將BSA-葡萄糖糖基化樣品置于冰水浴中終止反應，加入超純水復溶到BSA的質量濃度為10 g/L，并置于4 ℃冰箱中待測。

1.2.2 褐變程度的測定

參照JUNG等[1]的方法測定不同反應條件下BSA-葡萄糖體系在294 nm以及420 nm處的吸光值。

1.2.3 果糖胺含量的測定

采用GSP試劑盒測定BSA-葡萄糖糖基化體系中的果糖胺含量，在530 nm波長處測定樣品的吸光值。其中，標準溶液和標準空白溶液以試劑盒的方法配制。GSP含量的計算見公式(1)。

(2 mol/L)

(1)

1.2.4 羰基含量的測定

根據文獻[9]略作修改：取0.2 mL稀釋到適宜濃度的樣品與0.8 mL 0.1%的DNPH溶液(2.5 mol/L鹽酸配制)充分混合，室溫避光反應1.5 h。然后加入1 mL 20%的TCA，10 000 r/min離心10 min后棄上清液，得到的沉淀物用1 mL蒸餾水重新溶解，加入1 mL 10%的TCA，再次10 000 r/min離心10 min，棄上清液。沉淀物用1 mL 1∶1(V∶V)的乙酸乙酯-乙醇溶液洗滌2次,以除去未反應的有機試劑。最后將沉淀物溶于0.5 mL 6 mol/L的異硫氰酸胍溶液中，在370 nm處測定樣品的吸光值，并計算糖基化產物的羰基含量。

1.2.5 5-羥甲基糠醛含量的測定

根據文獻[10]略作修改：用超純水配制質量濃度分別為4、8、10、15、20、30和40 μg/mL的5-HMF標準品溶液，過0.22 μm水系濾膜后進行高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)上樣分析。取1 mL稀釋到適宜濃度的樣品溶液至15 mL離心管中，加入100 μL 6 mol/L的鹽酸混勻，煮沸15 min后，4 000 r/min離心20 min。最后取上清液過0.22 μm水系濾膜后HPLC上樣分析。色譜柱：Phenomenex C18長柱(5 μm，150 mm×4.6 mm)；流動相：V(甲醇)∶V(水)=30∶70；流速0.4 mL/min；柱溫：25 ℃；紫外檢測波長285 nm；進樣量：10 μL。

1.2.6 丙烯酰胺含量的測定

根據文獻[11]略作修改：用超純水配制質量濃度0.5、1、2、3、5、10、20、30和50 μg/mL的丙烯酰胺標準品溶液，過0.22 μm水系濾膜后進行HPLC分析。取1 mL稀釋到適宜濃度的樣品溶液，8 000 r/min離心20 min，取上清液過0.22 μm水系濾膜后進行HPLC分析。色譜柱：Phenomenex C18長柱(5 μm，150 mm×4.6 mm)；流動相：V(甲醇)∶V(水)=5∶95；流速0.4 mL/min；柱溫：30 ℃；紫外檢測波長205 nm；進樣量：20 μL。

1.2.7 熒光性AGEs測定

根據文獻[12]修改如下：取3 mL稀釋到適宜濃度的樣品溶液，采用F-7000熒光分光光度計測定其在激發波長370 nm，發射波長440 nm處的熒光強度，激發和發射波長的狹縫寬度均為5 nm，掃描速度為1 200 nm/min，電壓為400 V。樣品的熒光強度單位以任意單位(arbitrary units)表示。

1.2.8 類黑精含量的測定

根據文獻[13]修改如下：將樣品溶液稀釋到適宜的濃度，測定其在470 nm處的吸光值，通過Lamber-Beer等式計算樣品中類黑精的含量，其計算等式見公式(2)。

(2)

式中：c,類黑精的濃度(mmol/L)；A,樣品的吸光度(470 nm)；V,體積(mL)；e,類黑精的摩爾消光系數282 L/(mol·cm)；b，比色皿厚度(cm)。

1.3 數據處理

所有實驗均重復3次，實驗數據表示為平均值±標準偏差，采用Origin 8.6軟件作圖，SPPS 22.0軟件進行單因素方差分析(ANOVA)。P<0.05則認為樣品間具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 褐變程度分析

糖基化樣品在294 nm處的吸光值常被用來監測糖基化反應的初始速度，代表中間產物生成的量；而在420 nm處的吸光值可以用來反映末期產物的生成量[14-15]。不同反應時間和反應溫度制備的BSA-葡萄糖糖基化體系在294 nm和420 nm處的吸光值如圖1所示。當糖基化反應時間為6～48 h時，樣品的吸光值隨反應時間的延長逐漸增大，而超過48 h時，吸光值隨反應時間的延長逐漸下降，即55 ℃下反應超過12 h時，吸光值大幅度增加，反應48 h的樣品在294 nm和420 nm處吸光值最高(P<0.05)，分別為3.171和0.600。隨著反應溫度的升高，樣品在294 nm和420 nm處的吸光值呈增加的趨勢，即在本次實驗中，當反應溫度超過60 ℃時，吸光值大幅度增加，反應溫度達到100℃時，其在294 nm和420 nm的吸光值達到最大值，分別為5.033和0.688，且顯著高于50 ℃下制備的樣品(P<0.05)。

圖1 反應時間(A)和反應溫度(B)對BSA-葡萄糖體系在294nm和420nm處的紫外吸收的影響Fig.1 Effect of reaction time (A) and temperature (B) on the UV absorption of the BSA-glucose system at 294 nm and 420 nm注：不同小寫字母表示樣品在294 nm之間存在顯著性差異(P<0.05)；不同大寫字母表示樣品在420nm之間存在顯著性差異(P<0.05)

樣品在294 nm處的吸光值可用于評價糖基化反應中間產物的形成量。在糖基化反應的初始階段，葡萄糖脫水形成在294 nm有紫外吸收的中間產物并積累導致吸光值增加。但隨著反應時間的延長或反應溫度的升高，反應物逐漸被消耗，中間產物的積累速度變慢，吸光值增加緩慢。當糖基化反應到了最終階段，長時間的反應讓中間產物通過聚合逐漸形成最終產物，使反應72 h后體系的吸光值降低，這和AJANDOUZ等[15]報道相似。糖基化產物在420 nm和294 nm處的吸光值具有相似的變化趨勢，這與中間階段反應產物是最終階段反應產物的前體物質有關[16]。但在反應后期，樣品在420 nm處的吸光值變化不大甚至下降，這可能是由于生成越來越多不溶于水的類黑精所致。

2.2 果糖胺含量的分析

果糖胺是蛋白質進行非酶糖化而形成的糖化蛋白。高蛋白食品熱加工過程中都會產生果糖胺，食用過多含果糖胺的食品會導致人體血糖偏高[17]。由圖2可知，糖基化樣品中的果糖胺含量隨反應時間的延長和反應溫度的升高均呈現先增加后下降的趨勢(P<0.05)。

圖2 反應時間(A)和反應溫度(B)對BSA-葡萄糖體系中果糖胺濃度的影響Fig.2 Effect of reaction time (A) and temperature (B) on the content of fructosamine of BSA-glucose glycation system注：不同小寫字母表示樣品之間存在顯著性差異(P<0.05)。下同。

在反應時間超過12 h和反應溫度高于60 ℃時，果糖胺含量大幅度增加，并分別在24 h(2.36 mmol/L)和70 ℃(1.99 mmol/L)達到最大值。果糖胺含量增加的原因可能是，在反應初始階段，希夫堿環化形成相應的葡糖胺，經過分子重排后形成了果糖胺。但繼續延長反應時間或升高反應溫度，果糖胺逐漸被消耗形成類黑精而導致果糖胺含量下降[18]。雖然55 ℃反應72 h或100 ℃反應12 h制備的糖基化體系的果糖胺含量達到最低，但隨著反應時間和高溫的增加，反應速率加快，反應程度加深，其有害糖基化末期產物增加，對人體健康存在更大的威脅[19-20]。因此，在蛋白質類食品加工過程中，將糖基化反應溫度和時間應分別控制在60 ℃和12 h以內，能有效降低食品中果糖胺的含量。

2.3 羰基含量分析

羰基含量反映MR中間階段羰基化合物形成的量，可通過測定樣品中羰基含量來判斷食品中蛋白質是否被氧化[21]。由圖3可以看出，糖基化樣品中的羰基含量隨反應時間的延長和反應溫度的升高均呈先增加后下降的趨勢(P<0.05)。當糖基化反應在6～36 h和50～70 ℃內，羰基含量明顯增加，且在12 h和60 ℃大幅度增加，這是因為隨著反應程度的增加，BSA與葡萄糖反應形成大量的羰基化合物[22]。但繼續延長反應時間或者提高反應溫度，羰基含量逐漸減少，這可能是因為羰基化合物作為MR最終階段產物的前體物質，被消耗形成對人體有害的末期產物所致[9]。因此，將糖基化反應的溫度和時間應分別控制在60 ℃和12 h以內，可以有效地控制羰基化合物的形成，提高食品的相對安全性。

圖3 反應時間(A)和反應溫度(B)對BSA-葡萄糖體系中羰基濃度的影響Fig.3 Effect of reaction time (A) and temperature (B) on the content of carbonyl groups of BSA- glucose system

2.4 5-羥甲基糠醛含量的分析

本研究以峰面積為縱坐標(Y)，5-HMF的質量濃度為橫坐標(X)，繪制5-HMF的標準曲線：Y=129.36X-64.064(R2=0.999 2)，表明峰面積Y與5-HMF的質量濃度X(μg/mL)具有良好的線性關系，可用于計算樣品中5-HMF的含量。

5-HMF是一種具有呋喃環結構的糠醛化合物，廣泛存在于咖啡、焦糖制品、焙烤等食品中，可以改變食品的風味，已經被看作是帶有微弱致癌性的一種指標成分。在人體內，5-HMF可以代謝產生毒性更強的羥甲基糠醛酸、羥甲基糠醛次硫酸鹽等物質，具有很強的致癌致突變性[23]。反應時間和溫度對樣品中5-HMF含量的影響如圖4所示，當反應溫度為55 ℃時，樣品中5-HMF含量隨著反應時間的延長逐漸增加(P<0.05)，反應時間≤24 h時，5-HMF含量增加幅度較大，從6 h的36.10 μg/mL增加到了24 h的106.13 μg/mL。當糖基化時間為12 h時，5-HMF含量隨反應溫度的升高呈先增加后下降的趨勢，50 ℃時形成較少，含量為21.60 μg/mL，超過50 ℃時5-HMF大幅度增加，在70 ℃達到最大值(167.31 μg/mL)，當反應溫度超過70 ℃，5-HMF含量下降，且80～100 ℃反應12 h制備的樣品中5-HMF含量無顯著性差異(P>0.05)，這可能是因為5-HMF含量的變化是其形成和降解共同作用，隨著糖基化反應的進行，在己糖脫水形成5-HMF的同時，5-HMF與其他化合物反應生成類黑精等后期產物[22]。江姍姍等[10]研究表明，谷氨酸、賴氨酸、甘氨酸、半甘氨酸與葡萄糖的糖基化體系中5-HMF含量均隨著加熱時間的延長而增加。這一方面可能是因為氨基酸與葡萄糖體系的反應時間，最長反應時間僅為30 min，另一方面可能是因為BSA分子含有巰基，生成的5-HMF更容易被降解[10]。因此，將反應溫度和時間分別控制在60 ℃和12 h以內，可有效降低糖基化體系中5-HMF含量。

圖4 反應時間(A)和反應溫度(B)對BSA-葡萄糖體系中5-羥甲基糠醛含量的影響Fig.4 Effect of reaction time (A) and temperature (B) on the content of 5-HMF of BSA-glucose system

2.5 丙烯酰胺含量的分析

本研究以峰面積為縱坐標(Y)，丙烯酰胺的質量濃度為橫坐標(X)，繪制標準曲線：Y=456.58X-122.26(R2=0.998 4)。表明方程式的線性關系良好，可用于計算樣品中丙烯酰胺的含量。

丙烯酰胺是MR的中間產物，在國際上被認為是一類食源性有毒物質。動物實驗表明，丙烯酰胺對動物有神經毒性、生殖毒性，而且對嚙齒類動物具有致癌性[24-25]。被國際癌癥研究中心列為“人類可能的致癌物”[26]。反應時間和溫度對樣品中丙烯酰胺含量的影響如圖5所示，延長反應時間和升高反應溫度，均會增加樣品中丙烯酰胺的含量(P<0.05)。且溫度對丙烯酰胺形成的影響大于反應時間。當反應時間≤24 h，反應溫度≤80 ℃時，樣品中丙烯酰胺的含量明顯增加，表明此時丙烯酰胺在大量生成并逐漸積累，但隨著糖基化反應的持續進行，樣品中丙烯酰胺的含量增加不明顯，且無顯著性差異(P>0.05)，這和WEDZICHA等[27]報道的結果一致，這是因為丙烯酰胺本身降解或和其他物質發生反應導致其含量沒有增加。丁曉雯等[11]研究也表明油條中丙烯酰胺的含量隨著油炸時間和溫度的增加呈先增加后下降的趨勢，油炸溫度為160～200 ℃，油炸時間為3～5 min時，油條中產生的丙烯酰胺最多(134.15 μg/kg)。因此，將反應溫度和時間控制在60 ℃和12 h以內，可有效減少糖基化體系中丙烯酰胺的含量。

圖5 反應時間(A)和反應溫度(B)對BSA-葡萄糖體系中丙烯酰胺含量的影響Fig.5 Effect of reaction time (A) and temperature (B) on the content of acrylamide of BSA-glucose system

2.6 熒光性AGEs含量的變化

糖基化末端終產物(advanced glycation end products，AGEs)是指MR后期生成一類不可逆的有害糖基化終產物，主要是通過羰基化合物和氨基化合物經過復雜的反應生成熒光性AGEs。膳食是人體中AGEs的主要來源，AGEs在人體中的大量積累可導致糖尿病、尿毒癥、動脈粥樣硬化和阿爾茨海默癥等疾病的發生[28-29]。如圖6所示，當反應溫度為55 ℃時，AGEs含量隨著反應時間的延長呈先增加后下降的趨勢，且在48 h達到最大值，約為6 h的4.6倍；當反應時間為12 h時，在50～80 ℃時，反應體系中AGEs含量大幅度增加，并在80 ℃達到最大值，約為50 ℃的12.8倍。表明隨著反應時間的延長和反應溫度的升高會促進糖類物質發生羥醛縮合生成羰基化合物，進而形成的AGEs也越多。但隨著反應時間和反應溫度的逐漸增加，樣品的顏色加深，熒光值降低，這可能是在末期階段中的羰基含量下降或熒光性AGEs逐漸生成了棕色的類黑精所致。根據房紅娟等[12]的研究，BSA-葡萄糖模擬體系中AGEs含量也是隨著加熱時間的延長和加熱溫度的升高具有先增加后減少的趨勢，表明熒光性AGEs聚合形成無熒光性的AGEs，并不是隨著反應程度的加深而一直增加。在本次實驗中，AGEs含量雖然在72 h和100 ℃有所下降，但此時反應體系中5-HMF和丙烯酰胺的含量較高。因此，將反應溫度和時間分別控制在60 ℃和12 h以內，可有效減少糖基化體系中AGEs的生成，進而提高食品的安全性。

圖6 反應時間(A)和反應溫度(B)對BSA-葡萄糖體系中的熒光性AGEs生成的影響Fig.6 Effect of reaction time (A) and temperature (B) on the formation of fluorescent AGEs in BSA-glucose system

2.7 類黑精含量變化

類黑精是指MR后期生成的一種結構復雜的棕褐色高分子化合物，具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌、降糖和降血壓等生理功能[30]。由圖7可知，BSA-葡萄糖樣品中的類黑精含量隨著反應時間的延長和反應溫度的升高均呈現出先增加后下降的趨勢(P<0.05)。反應時間和溫度在12 h和60 ℃之內，糖基化體系中的類黑精含量增加緩慢，當反應時間和溫度分別超過12 h和60 ℃時，其含量大幅度增加，分別在48 h(0.14 mmol/L)和80 ℃(0.10 mmol/L)達到最大值。這是因為類黑精的生成量與丙烯酰胺含量具有顯著的相關性[31]，由圖5可知，糖基化體系中丙烯酰胺的含量在反應時間48 h和反應溫度80 ℃時分別達到最高值。但當反應時間超過48 h，反應溫度超過80 ℃時，類黑精含量顯著下降，這可能是因為形成的部分大分子類黑精難溶于水，也有可能是溫度過高或者長時間處理樣品使部分類黑精發生裂解所致[16]。

圖7 反應時間(A)和反應溫度(B)對BSA-葡萄糖體系中類黑精含量的影響Fig.7 Effect of reaction time (A) and temperature (B) on the content of melanoidin of BSA-glucose system

3 結論

針對食品熱加工過程中會形成有害糖基化產物的現狀，本文旨在研究反應時間和反應溫度的變化對糖基化產物形成的影響。結果表明，反應溫度為55 ℃時，糖基化體系中的果糖胺、羰基、AGEs和類黑精含量隨反應時間的延長呈先增加后下降的趨勢，但5-HMF和丙烯酰胺含量逐漸增加；反應時間為12 h時，糖基化體系中的果糖胺、羰基、5-HMF、AGEs和類黑精含量隨反應溫度的升高呈先增加后下降的趨勢，但丙烯酰胺含量逐漸增加。反應時間和反應溫度分別超過12 h和60 ℃時，體系中的果糖胺、羰基、5-HMF、丙烯酰胺、AGEs和類黑精含量大幅度增加。因此，將反應溫度控制在60 ℃以內，反應時間不超過12 h時，能有效減少BSA-葡萄糖體系中有害糖基化產物的產生，本研究結果可為高蛋白、高糖類食品在熱加工過程中有害糖基化產物形成的調控提供一定的科學依據。