澳洲堅果糖蛋白的分離純化及其體外抗氧化能力

張翔，李星星，黃雪松

(暨南大學 食品科學與工程系，廣東 廣州，510632)

澳洲堅果(MacadamiaternifoliaF. Muell.)別名：昆士蘭栗、澳洲胡桃、夏威夷果、昆士蘭果，原產于澳大利亞[1]，其果仁不僅口感酥脆、風味獨特，而且營養豐富。其含油量80%，多糖含量6%，蛋白質含量9%[2]。近年來，我國澳洲堅果產業規模不斷擴大，產業鏈繼續延伸，但其深加工產品甚少，部分堅果用于榨油，但榨油后所產生約20%油粕仍未開發利用，造成了較大的資源浪費。因此，亟需開發利用澳洲堅果油粕的生產技術。

糖蛋白是一類由糖類與多肽或蛋白質以共價鍵連接而成的結合蛋白，含有肽鏈、糖肽鍵和糖鏈等結構[3]。隨著糖生物學的不斷發展，越來越多的研究表明糖蛋白復合物具有增強免疫調節[4]、抑制腫瘤[5]、降低血糖[6]、血酯[7]、抗氧化[8]、防衰老[9]等活性功效[10]，也有具有多種功能的糖蛋白，這些活性使其在保健食品及新藥開發方面具有極大應用價值。目前國內的文獻中，報道了不同澳洲堅果不同種質果仁粗脂肪及脂肪酸成分[11]和澳洲堅果多肽的制備[12]，但未見有關澳洲堅果糖蛋白及其生理活性的報道。本文擬以澳洲堅果油粕為原料，分離、純化、鑒定澳洲堅果中的糖蛋白，為進一步開發利用澳洲堅果提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

澳洲堅果油粕，由廣西省岑溪市壽香鄉有機農產品開發有限公司惠贈；Sephadex G-100 凝膠，美國GE公司；DEAE-52纖維素，上海鼎國生物技術有限公司；NaOH、HCl、葡萄糖、苯酚、硫酸、三氟乙酸、氯仿、無水乙醇:分析純,天津市大茂化學試劑廠。

DF-101S集熱器恒溫加熱磁力攪拌器，河南碩杰儀器設備有限公司；PHS-3C雷磁pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；UV-9600紫外-可見分光光度計，北京瑞利分析儀器公司；SCIENTZ-10N冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司；LC-20A高效液相色譜儀器，日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取方法

稱取200 g澳洲堅果油粕，加入300 mL正己烷，置于磁力攪拌器攪拌6 h，過濾，待澳洲堅果中的正己烷完全揮發后獲得約140 g完全無脂肪的澳洲堅果仁脫脂粉。按照m(脫脂粉)∶m(水)=1∶12的比例加入水，經熱水浸提；將熱水浸提后的殘渣再按照料液比1∶12用1 mol/L Na2CO3調節提取液pH值為9.0，加熱至沸提取3 h。提取液經抽濾后，于60 ℃減壓濃縮至一定體積，采用30%、60%、90%的乙醇溶液分級沉淀，得90%乙醇沉淀后用無水乙醇和丙酮洗滌沉淀，用雙蒸水溶解沉淀后凍干。

1.2.2 分離純化

使用14 kDa的透析袋，將粗提物透析48 h后，凍干后待用。

(1)DEAE-52陰離子交換柱分離純化

稱取100 mg澳洲堅果粗提物，溶于20 mL雙蒸水中，用移液槍貼壁緩慢加樣至DEAE-52陰離子交換柱(2.5 cm×30 cm)，待其完全進入層析柱后，用雙蒸水洗脫2 h，然后依次采用0.2、0.4、0.6 mol/L NaCl溶液洗脫，使用恒流泵控制洗脫流速為1 mL/min，每管收集10 mL，采用苯酚硫酸法跟蹤檢測各管中的多糖含量。同時以收集的管數為橫坐標，于紫外490 nm測定的吸光值為縱坐標,繪制洗脫曲線。收集吸收峰樣品，透析凍干。

(2)Sephadex G-100分離純化

將(1)中收集的樣品配成質量濃度為10 g/L，上樣于Sephadex G-100層析柱(1.2 cm×50 cm)，采用雙蒸水洗脫，使用恒流泵控制洗脫流速為0.5 mL/min，每管收集5 mL，按照(1)中所述的方法繪制洗脫曲線，收集吸收峰樣品凍干。

1.2.3 結構分析

(1)HPLC鑒定純度和測定分子量

將色譜純葡萄糖、T-5、T-40、T-200、T-2000葡聚糖均用雙蒸水配5 g/L多糖分子量標樣，經0.45 μm濾膜過濾后進樣。同時采用葡萄糖和T-2000葡聚糖標定Vt和V0，由保留時間Ve計算得到相應的分配系數Kav，計算公式如公式(1)所示：

(1)

以分子量的對數(lgMw)為橫坐標，Kav為縱坐標繪制標準曲線，得標準曲線回歸方程為：y=-0.207 5x+1.282 5，R2=0.985。同時將澳洲堅果糖蛋白進樣，根據保留時間計算相對分子質量。

色譜條件：色譜柱為PolySep-GFC-P4000柱(7.8 mm×300 mm)，流動相為純水，流速0.5 mL/min，柱溫30 ℃，檢測器為ELSD蒸發光散射檢測器。

(2)紫外-可見光光譜掃描

將澳洲堅果糖蛋白配成質量濃度為0.5 g/L，在波長200～800 nm處進行掃描。

(3)多糖和蛋白含量的測定

蛋白含量測定采用2，2′-聯喹啉-4，4′-二羧酸法(BCA法)[13]，總糖含量測定采用苯酚硫酸法[14]。

(4)紅外光譜分析

稱取1 mg澳洲堅果糖蛋白樣品，取適量KBr粉末與樣品在瑪瑙研缽中充分研磨均勻后，用壓片機壓成薄片，采用傅里葉變換光譜進行掃描[15]，掃描次數為32次，掃描范圍4 000～400 cm-1。

(5)糖肽鍵的測定

通過β-消去反應測定澳洲堅果糖蛋白中的O-糖肽鍵[16]。稱取2 mg樣品溶解于0.2 mol/L NaOH溶液中，另取2 mg樣品溶解于蒸餾水中作為對照，在45 ℃水浴鍋中反應60 min,于波長200～350 nm范圍內進行紫外掃描。

(6)單糖組成分析

①混合單糖標準品衍生化

采用PMP柱前衍生化高效液相色譜法測定澳洲堅果糖蛋白的單糖組成[17]。分別配制質量濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/L的各單糖標準品溶液以及各單糖的標準混合溶液，移取100 μL各單糖的標準溶液，分別加入100 μL 0.3 mol/L NaOH和100 μL 0.5 mol/L PMP-甲醇溶液，于70 ℃電熱恒溫鼓風干燥箱中反應90 min，反應結束后冷卻至室溫，加入100 μL 0.3 mol/L HCl中和后再加入1 mL純水，然后加入2 mL氯仿漩渦萃取5 min，10 000 r/min離心10 min，棄去氯仿層，重復萃取3次，取水相經0.45 μm濾膜過濾后進樣分析繪制標準曲線。

色譜條件：色譜柱為Bio-Bond 5 μm C18(4.6 mm×250 mm)；流動相為V[0.05 mol/L KH2PO4(pH=6.9)]∶V(乙腈)=78∶22，流速為0.6 mL/min，進樣體積10 μL，柱溫30 ℃。

如圖1所示，7種標準單糖的峰型勻稱，混合單糖在高效液相色譜中能夠具有較好的分離效果。

1-甘露糖;2-葡萄糖醛酸;3-鼠李糖;4-半乳糖醛酸;5-核糖; 6-半乳糖;7-阿拉伯糖圖1 混合單糖標準品的高效液相色譜圖Fig.1 High-performance liquid chromatograms of mixed monosaccharide standards

②水解糖蛋白

采用三氟乙酸水解澳洲堅果糖蛋白[18]。稱取澳洲堅果糖蛋白5 mg，加入5 mL 4 mol/L三氟乙酸，110 ℃下水解6 h，減壓濃縮干燥后，加入甲醇洗滌3次，旋蒸除去溶劑后，加入1 mL純水溶解，得水解樣品溶液。取100 μL水解樣品溶液進行柱前衍生化實驗，測定單糖組成。

(7)體外抗氧化活性測定

通過測定總還原能力、清除DPPH自由基能力對提取純化的澳洲堅果糖蛋白M-1的抗氧化能力進行評定。采用DPPH法測定DPPH自由基清除率[19]，采用鐵氰化鉀法測定總還原力[20]。以上測定均采用維生素C(VC)作為對照，并按照公式(2)進行計算：

(2)

公式中：Aj為對照品吸光度；Ai為樣品吸光度。

2 結果與分析

2.1 分離純化結果

2.1.1 DEAE-52柱層析分離結果

如圖2所示，經DEAE-52層析柱分離出2個部分，分別為0.2、0.4 mol/L NaCl溶液洗脫出的部分，按照圖2所示的出峰管號，因峰2樣品含量較少，故取峰1量大的部分用于進一步研究。收集峰1吸收峰的各管溶液，60 ℃下減壓濃縮，雙蒸水透析48 h，凍干透析后的樣品得澳洲堅果多糖組分，用于進一步Sephadex G-100凝膠層析柱純化。

圖2 澳洲堅果多糖DEAE-52洗脫曲線Fig.2 DEAE-52 elution curves of macadamia polysaccharide

2.1.2 Sephadex G-100凝膠柱層析結果

由圖3所示，DEAE峰1樣品經葡聚糖凝膠G100層析柱分離，得到單一峰樣品，可見該峰純度比較高，可作為進一步研究其理化性質的純多糖。收集吸收峰樣品，凍干得澳洲堅果多糖樣品，記為“M-1”。

圖3 峰1葡聚糖凝膠G100洗脫曲線Fig.3 Sephadex G100 elution curve of peak 1

2.2 M-1的鑒定與分析

2.2.1 M-1的鑒定和分子量測定

由圖4所示，經高效液相色譜與蒸發光散射檢測器聯用法測定純度和分子量。峰型單一對稱，且純度達到99.54%，根據標準曲線計算得出M-1的分子量為492 kDa。

圖4 M-1的高效液相色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of M-1

2.3.2 M-1的紫外-可見光光譜分析

根據圖5 UV-Vis掃描結果顯示，純化后的M-1在280 nm處存在一個肩峰，此處是蛋白的特征吸收峰。因此，表明M-1中含有蛋白質，初步判斷M-1為糖蛋白。

圖5 M-1紫外-可見光光譜掃描Fig.5 UV-Vis scanning spectra of M-1

2.3.3 M-1中糖與蛋白的測定結果

表1列出了M-1的蛋白和總糖質量分數?？芍琈-1是一種糖量相對較高的糖蛋白，其蛋白質量分數為34.13%，總糖質量分數為55.81%。根據圖4與表1綜合判斷，可以確認M-1為糖蛋白。

表1 M-1的蛋白和總糖質量分數Table 1 Protein and carbohydrate contents of M-1

但是，M-1中尚有約10%未知物，有可能是有些組成成分未顯示測定糖與蛋白的反應，或是其他原因，有待進一步分析研究。

2.3 M-1的部分結構解析

2.3.1 紅外光譜分析

圖6 M-1的紅外光譜圖Fig.6 Infrared spectrum of M-1

而3 406 cm-1處附近的強吸收峰，表明有O—H鍵和N—H鍵伸縮振動而增寬的多重吸收峰；2 933 cm-1處是糖類的甲基、亞甲基等烷基C—H鍵的伸縮振動峰；1 406 cm-1處是甲基、亞甲基的面內變角振動峰。M-1在1 039、1 071、1 095 cm- 1處有3個明顯而尖銳的吸收峰，這是吡喃環的特征峰；893 cm-1處較弱的吸收峰是β-型糖苷鍵C—H的特征吸收峰。這些都是多糖的特征吸收峰。

從上述兩個方面，證實M-1中含有蛋白和多糖的特征吸收峰，進一步證實其為糖蛋白。

2.3.2 糖肽鍵的證實

澳洲堅果糖蛋白M-1經稀堿處理前后見圖7，可以看出樣品在未經稀堿處理之前在240 nm的吸光值為0.397，經β-消除反應處理后在240 nm處的吸光值升到了0.736，出現了明顯的特征吸收，表明澳洲堅果糖蛋白M-1存在O-糖肽鍵，并主要以O-糖肽鍵的形式鏈接。

圖7 堿處理前后紫外掃描光譜圖Fig.7 UV scanning spectra of M-1 before and after alkali treatment

當糖蛋白中多糖鏈以O-糖肽鍵的形式與絲氨酸和蘇氨酸結合時，經稀堿處理(β-消去反應) 后，糖肽鍵發生解離，解離后的絲氨酸或蘇氨酸形成α-氨基丙烯酸或α-氨基丁烯酸，這兩種氨基酸在紫外波長 240 nm處有特征吸收。因此測定M-1在稀堿處理前后波長 240 nm處吸收的變化即可判斷是否含有O-糖肽鍵。

2.3.3 M-1中的單糖組成與比例

如圖8所示，根據單糖標準品的保留時間和各單糖的標準曲線，分析得出M-1主要由鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖組成，其摩爾比為1∶2.23∶3.88∶5.88，其摩爾比近似約為1∶2∶4∶6。

圖8 M-1 PMP衍生化的高效液相色譜圖Fig.8 High performance liquid chromatogram of PMP derivatization of M-1

2.4 M-1的抗氧化特性

2.4.1 總還原力的測定

如圖9所示，與Vc相比，M-1的還原力較弱，但隨著M-1樣品濃度的增加，其還原力也逐漸增加，當濃度達到10 g/L時，其還原力最大。

圖9 M-1的總還原力Fig.9 Reducing power of M-1

還原力的大小即代表了M-1的抗氧化能力的強弱。Fe3+能夠接受溶液中抗氧化劑提供的電子，然后還原成Fe2+，同時Fe2+在波長700 nm處有最大吸收，其吸收強度與其含量呈定量關系。因此，700 nm處的吸光值反映了給電子能力的強弱，從而判斷M-1的抗氧化性。

2.4.2 DPPH自由基清除率測定

如圖10所示，2～10 g/L的M-1隨著樣品質量濃度的升高，清除DPPH自由基的能力也逐漸升高，但明顯弱于Vc。當濃度達到10 g/L時，清除率最高，此時清除率達到78.67%。證明M-1具有較強的DPPH自由基清除能力。

圖10 M-1對DPPH自由基的清除作用Fig.10 DPPH radical-scavenging capacity of M-1

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基是一種帶有單電子的自由基，其乙醇溶液呈紫色并在波長525 nm處有強吸收。DPPH自由基能夠與單電子配對從而使其吸光度逐漸消失，其褪色程度也與其接受的電子數量成定量關系，因此可用525 nm波長處的吸光度表示DPPH自由基的清除能力。

通過測定M-1的總還原力和DPPH自由基清除率，表明M-1具有較好的抗氧化活性，且M-1的抗氧化作用與其結構有關。M-1中蛋白質部分的酚性氨基酸(如酪氨酸等)可能是產生自由基清除作用的原因。文獻表明，糖蛋白中蛋白質的含量和組成在抗氧化作用中占有重要的地位[21]，推測M-1的抗氧化活性可能與其氨基酸組成有關；糖蛋白中多糖的糖苷鍵的鏈接方式[22]和單糖組成[23]也可能是影響其抗氧化作用的因素之一，M-1中含有的鼠李糖可能與其抗氧化活性有關。本文初步研究了M-1的部分結構信息，對于影響M-1生物活性的氨基酸組成和糖苷鍵鏈接方式等高級結構信息需待進一步的研究。

3 結論

本實驗通過弱堿提取、乙醇分級沉淀、DEAE-52纖維素交換、葡聚糖凝膠G-100分離得到分子質量為472 kDa的澳洲堅果糖蛋白M-1。其多糖含量為55.81%，蛋白含量為34.13%。通過單糖組成分析實驗得出澳洲堅果糖蛋白單糖有鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖，其組成比例為1∶2∶4∶6，且可能具有益生元功能。β-消除反應前紫外吸收的變化表明澳洲堅果糖蛋白含有O-糖肽鍵。紅外光譜表明其含有糖和蛋白的特征吸收峰。根據其單糖的組成判斷，M-1應具有增殖益生菌作用。通過測定總還原力和DPPH自由基清除率，表明澳洲堅果糖蛋白在一定的質量濃度范圍內具有抗氧化活性。這些研究結果對進一步深入研究M-1的分子結構、理化性質、生物活性、開發利用等奠定了基礎。