基于超高效液相色譜串聯三重四級桿質譜的不同產區赤霞珠葡萄酒花色苷特征性研究

唐柯，張小倩，李記明，姜文廣，徐巖*

1(工業生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122) 2(食品科學與技術國家重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122) 3(江南大學 生物工程學院，釀酒微生物與酶技術研究室，江蘇 無錫，214122) 4(煙臺張裕葡萄釀酒股份有限公司，山東 煙臺，264000)

顏色是葡萄酒質量評判的重要依據之一。一方面，花色苷是紅葡萄酒中主要的呈色物質，對紅葡萄酒的顏色起著決定性作用[1-2]；同時花色苷還可與其他物質(如單寧)結合，進而影響葡萄酒的口感，從而對葡萄酒的品質產生重要的影響[3]。葡萄酒中的花色苷，一部分來自葡萄中的花色苷，另一部分則是花色苷在發酵過程中與其他物質反應，形成花色苷的衍生物[4]。花色苷具有類黃酮物質C6—C3—C6的基本結構[5]。

葡萄酒中花色苷主要以游離、結合以及聚合的狀態存在，其中游離態花色苷主要存在于新鮮葡萄酒中，是新鮮葡萄酒的主要呈色物質，而陳釀葡萄酒的顏色主要由花色苷聚合作用決定[6]。游離態花色苷在葡萄酒儲存階段與其他物質結合而逐漸消失，結合態及聚合態花色苷則受酒齡影響較小[7]。雖然游離態花色苷在紅酒儲存過程中的濃度不斷下降，但紅酒仍能保持基本的紅色。而這些聚合反應涉及復雜的機制，包括短期的機制，如自聚合和輔色作用，以及相對長期的機制，如與黃烷-3-醇、原花青素形成聚合花色苷，以及形成新的色素，如吡喃花色苷及其進一步的聚合產物等[8-9]。此外，在新鮮紅葡萄酒中游離花色苷的質量濃度大約在400～1 000 mg/L，但在某些情況下可能超過2 000 mg/L[10-11]。

我國葡萄種植區分布非常廣泛，從東到西或從南到北分布于中國各地，距離超過2 000 km。這些區域生態條件差異明顯，如山東葡萄產區屬于半濕潤氣候區，寧夏葡萄產區屬半干旱氣候區，新疆葡萄產區屬干旱氣候區[12]。而氣候的多樣性賦予了不同產區葡萄酒不同的風格和顏色特征。因此，了解不同產區葡萄酒花色苷的組成對于葡萄酒生產是非常有意義的。超高效液相色譜串聯三重四級桿質譜(ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry/-mass spectrometry，UPLC-MS/MS)是近年來色譜檢測技術的一個重大發展，通過獲得目標物的結構信息，從而可以更多地推斷出目標物的種類。而目前國內采用UPLC-MS/MS對產區葡萄酒花色苷的分析還鮮有報道。

赤霞珠葡萄是我國種植面積最大的一個釀酒葡萄品種，本文通過UPLC-MS/MS對我國4個主要產區(山東煙臺、陜西涇陽、寧夏賀蘭山東麓、新疆石河子)赤霞珠葡萄新酒中主要游離花色苷進行分析，明確不同產地赤霞珠葡萄酒中花色苷的種類、含量和組成特征，并進一步利用統計學方法，探討基于花色苷的葡萄酒產地特征性。本研究既可以為建立不同產區葡萄酒花色苷評價體系提供理論參考，同時也可以為葡萄酒的產地鑒別提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

所有赤霞珠葡萄酒樣品均由張裕葡萄釀酒股份有限公司提供，來自山東煙臺(4)、寧夏賀蘭山東麓(7)、陜西涇陽(5)、新疆石河子(6)4個產區。均為2017年葡萄，釀造工藝相同，所有樣品于酒精發酵結束2個月后測定。

濃HCl、NaCl、醋酸、醋酸鈉、Na2CO3(上海國藥集團，分析純)；UPLC分析使用的流動相包括甲酸、乙腈(上海安譜科學儀器有限公司，色譜純)；福林-肖卡試劑、Malvidin-3-O-glucoside標準品(Sigma-Aldrich公司，純度90%以上，色譜純)。

1.2 儀器與設備

Waters H-Class超高效液相色譜儀，美國Waters公司；A380型紫外分光光度計，翱藝(上海)儀器有限公司；純水儀，美國Millipore公司；超聲清洗器，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 花色苷標準曲線的繪制

使用甲醇(色譜級)將1 mg的二甲花翠素葡萄糖苷(malvidin-3-O-glucoside，課題組制備，純度98.63%[13])溶解，定容于5 mL的容量瓶中，搖勻。然后取0.1 mL溶液，進行不同質量濃度梯度稀釋。然后將各稀釋液過0.22 μm的有機相濾膜，進行液相色譜分析，以質量濃度梯度為橫坐標，液相色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線得到標準曲線方程為：y=7 433.3x-2 003.1,R2=0.999 9。

1.3.2 葡萄酒花色苷的UPLC-MS/MS分析

采用Waters超高效液相色譜儀在520 nm進行葡萄酒花色苷的檢測，BEH C18色譜柱(i.d. 100 mm×2.1 mm，1.7 μm，Waters)柱溫45 ℃，進樣體積5 μL，流速0.3 mL/min，流動相A：純乙腈，流動相B：2%甲酸。洗脫梯度：0～20 min，2%～16% A；20～28 min，16%～23% A；28～30 min，23%～50% A；30～35 min，50%～100% A；35～37 min，100% A；37～38 min，100%～2.0% A。質譜采用電噴霧離子源(ESI)，正離子模式，離子掃描范圍：100～1 000m/z；霧化器壓力：35 psi；干燥氣流速：10 L/min；干燥氣溫度：325 ℃。葡萄酒樣品過0.45 μm濾膜后直接

測定。

1.3.3 數據處理方法

所有樣品檢測均重復3次，采用XLSTAT 2014 (Addinsoft， Paris， France)進行多元統計分析。

2 結果與分析

2.1 葡萄酒中主要游離花色苷檢測方法的建立

目前,UPLC-MS/MS已經成為花色苷研究不可替代的重要方法，但是花色苷的乙酰化、香豆酰化等的形式過多，無法也沒有標準品進行一一比對。因此，本研究基于花色苷的紫外-可見光譜、MS的特征離子、碎片離子和文獻結合，分析樣品中所含游離花色苷的種類。圖1為赤霞珠葡萄酒花色苷的UPLC色譜圖。

圖1 赤霞珠葡萄酒花色苷UPLC圖(520 nm)Fig.1 UPLC chromatogram (520 nm) of anthocyanins in Cabernet Sauvignon wine

5種花色苷單體在MS/MS的正離子模式下，丟失3位上的葡萄糖或酰化葡萄糖，產生相應的花色苷配基碎片離子。Dp、Cy、Pt、Pn、Ma裂解丟失葡萄糖(M-162)+，分別得到m/z303、287、317、301、331的碎片。其他游離花色苷也在該模式下，由于能量的增強，分子離子破碎，出現對應特征離子。表1為葡萄酒中花色苷的定性分析結果，赤霞珠葡萄酒中共檢測到16種游離花色苷。除了5種基本花色苷及其乙酰化和香豆酰化衍生物外，本研究還檢測到了花色苷的丙酮酸衍生物和乙醛衍生物。通常，花色苷丙酮酸衍生物出現早于乙醛，在發酵的初期產生，在發酵后期，酵母營養不足時會利用丙酮酸，使其含量下降。花色苷乙醛衍生物在發酵結束時產生，它與發酵的糖量密切相關[14]。

2.2 不同產地赤霞珠葡萄酒花色苷組成分析

表2是赤霞珠葡萄酒中主要花色苷的種類和含量。

表1 葡萄酒中花色苷的定性分析結果Table 1 The qualitative results of anthocyanins in wine

表2 赤霞珠葡萄酒游離花色苷種類與含量 單位：mg/L

注：“-”，未檢測到；NX，寧夏；SD，山東；SX，陜西；XJ，新疆

從表2中可以看出,產區赤霞珠葡萄酒中花色苷的組成基本一致，含量最多的花色苷均為二甲花翠素葡萄糖苷，在160.29～520.95 mg/L；二甲花翠素乙酰化葡萄糖苷則次之，含量在60.15～229.02 mg/L；其他含量較高的花色苷還包括甲基花翠素葡萄糖苷、甲基花青素葡萄糖苷及二甲花翠素反式香豆酰化葡萄糖苷。這與張瑛莉等[15]所做的研究結果基本一致，張瑛莉等發現赤霞珠葡萄酒中最主要的花色苷是二甲花翠素葡萄糖苷，占相對含量的50%以上，煙臺和昌黎產區酒的含量基本相同，為59.17%和59.96%，新疆伊犁產區酒的含量稍低，為55.13%。含量其次的是二甲花翠素乙酰化葡萄糖苷，3個產區葡萄酒基本相同，均占到總含量的20%左右。3個產區酒中其他7種花色苷物質含量均較少，濃度差異不大。此外，張瑛莉等只檢測到9種花色苷，而本實驗則檢測到16種花色苷，采用UPLC-MS/MS的方法可以更加全面的對花色苷進行分析。

圖2為赤霞珠葡萄酒不同產區間花色苷含量比較。相對于其他3個產區，寧夏產區的赤霞珠總花色苷含量具有較大優勢，含量在621.86～997.68 mg/L，平均含量為840.85 mg/L；山東、新疆的花色苷含量都介于600～700 mg/L，而陜西產區最低，在309.07～667.54 mg/L，平均含量僅為523.73 mg/L。LIANG等對甘肅祁連、寧夏玉泉營、河北懷來、河北昌黎、山東蓬萊5個產區赤霞珠葡萄酒中花色苷含量進行分析，結果發現河北懷來與河北昌黎葡萄酒中花色苷含量顯著低于其他3個產區，寧夏玉泉營與甘肅祁連2個產區花色苷含量較高[16]。有研究報道，寧夏產區的晝夜溫差大，溫度無霜期較長，有效積溫較高，熱量條件適中，干燥度較大，土質多為沙壤土部分含有礫石，較適宜赤霞珠生長[17]。

圖2 不同產區赤霞珠葡萄酒花色苷平均含量比較Fig.2 The average content of anthocyanins in the Cabernet Sauvignon wines among different production places

2.3 不同產地赤霞珠葡萄酒花色苷特征分析

判別分析適用于分類明確、依據研究對象的特征值判別并劃分歸屬的問題，是一種多元統計分析的方式。依據不同的判別方法，建立相應的判別函數，以研究對象的信息資料來確定判別函數中的未知系數，得出判別標準，以此來歸屬樣本。本文以山東、新疆、寧夏、陜西4個產地作為分類依據，基于16種游離花色苷的種類和含量進行產區的判別分析。

從圖3可以看出，根據樣品中花色苷的種類和含量可以將4個產區進行良好的區分，4個產區的赤霞珠葡萄酒各自聚為一類。此外，寧夏產區和新疆產區與其他產區有著顯著的差異，分別分布在第二象限和第三象限；山東產區和陜西產區葡萄酒花色苷特征則較為接近，特征區域相鄰。

圖3 不同產地葡萄酒基于花色苷判別分析圖Fig.3 DA map based on anthocyanins according to geographic origin

表3為基于花色苷種類和含量的產地判別分析結果，4個產區的正確預測率均為100%。近年來，關于通過葡萄酒的風味成分對產地、品種特征性的研究持續不斷，如SOUFLEROS等[18]對希臘的42款白葡萄酒進行分析，結果表明采用判別分析可以通過氨基酸譜將葡萄品種、年份、地理來源和釀酒類型進行良好分類。RODRGUEZ-DELGADO等[19]則實現基于單體酚的種類和含量對西班牙紅葡萄酒的產地、品種和年份的有效識別。而從本研究的結果可以看出，利用花色苷同樣能夠將不同產區的葡萄酒區分開，實現葡萄酒在產地間的有效識別，葡萄酒基于花色苷的種類和含量具有良好產地特征性。

表3 產區判別分析結果Table 3 DA results according to geographic origin

3 結論

根據MS質譜圖的分子離子和碎片離子的分析，并與文獻報道的碎片信息比對，共定性出16種游離花色苷。赤霞珠葡萄酒第一特征花色苷是二甲花翠素葡萄糖苷，含量160.29～520.41 mg/L；二甲花翠素乙酰化葡萄糖苷則次之，含量60.15～229.02 mg/L。赤霞珠在寧夏產區的花色苷含量具有較大優勢，含量在800～900 mg/L之間，山東、新疆的花色苷含量都介于600～700 mg/L之間，而陜西最低，在600 mg/L之下。根據XLSTAT 2014分析結果，可以看出不同產區赤霞珠葡萄酒基于葡萄酒花色苷的線性判別分析得到滿意的結果，正確預測率為100%。