基于磁性納米材料和適配體的熒光傳感器檢測牛奶中黃曲霉毒素M1

郭婷，林淑鳳，馬良，譚紅霞，張宇昊

(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)

目前，乳及乳制品受到黃曲霉毒素M1(aflatoxin M1, AFM1)污染的現象越來越嚴重。2011年國家質檢總局抽檢某批次純牛奶AFM1超標140%；2012年廣州工商局抽檢發現部分幼兒奶粉AFM1含量超標；2014年國家食藥監總局公布抽檢的部分奶粉樣品AFM1超標。AFM1是哺乳類動物攝入被黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1, AF B1)污染的飼料后，在體內的肝微粒體單氧化酶系催化下，通過細胞色素P-448調節作用，其末端呋喃環C-10被羥化而生成AFM1存在于動物分泌的乳汁和尿液中，以乳中最為常見[1]。AFM1被世界衛生組織列為I類致癌物，具有強致癌性和致突變性。中國、美國等國家規定乳及乳制品中AFM1最大限量為0.5 μg/kg[2]，歐盟規定生乳中AFM1的最大限量為0.05 μg/kg，嬰兒配方乳粉中為0.025 μg/kg[3]。

目前AFM1檢測方法主要有高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)[4-9]、免疫親和層析法(immunoaffinity chromatography，IAC)[10-12]、酶聯免疫吸附法(enzyme linked immune sorbent assay，ELISA)[13-14]等。其中色譜檢測方法靈敏，穩定性強，但樣品前處理復雜，成本高，不能滿足目前食品安全快速檢測的要求。ELISA法操作簡便、用時短，但抗體的制備周期較長且穩定性差。與其相比，適配體可體外合成，穩定性好，在食品安全檢測領域顯示了巨大的應用前景。

近年來，越來越多的科研工作者構建基于適配體的傳感器[15-18]。YANG等[19]使用未修飾的金納米粒子(AuNPs)作為指示劑,實現對赭曲霉毒素(ochratoxin,OTA)的快速檢測。當工作液中沒有OTA時，適配體吸附在AuNPs表面，在鹽溶液中保護AuNPs，未發生聚集現象，溶液為紅色。當加入OTA后，適配體與OTA結合從而構象變化形成G-四聯體結構，而AuNPs在在鹽誘導下發生聚集導致顏色變化。BONEL等[20]開發了一種競爭性電化學傳感器用來檢測OTA。對辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)的活性反應進行檢測，根據活性變化檢測OTA。GUO等[21]利用PCR技術結合適配體實現了AFB1的痕量檢測，檢測限為25 fg/mL。

熒光傳感器因其簡便、高靈敏、快速等優點而被廣泛的應用于檢測領域[22-26]。隨著納米技術的快速發展，越來越多的納米材料(石墨烯、碳納米管、二硫化物等[27-32])應用在熒光傳感器方面。GUO等[33]開發一種基于單壁碳納米管(single-walled carbon nanotubes, SWNTs)的熒光傳感器用于檢測OTA。利用熒光染料修飾適配體，SWNTs對染料具有很強的猝滅效果；但當加入OTA時，其與適配體結合，使得適配體從SWNTs表面釋放下來，熒光恢復。LV等[34]在以上實驗基礎上利用DNA酶進行信號放大，進一步提高了檢測的靈敏度。然而，在實際熒光檢測過程中，工作液中混合納米材料及目標物等多種物質，納米材料的存在增加本底值的干擾，影響檢測靈敏度。

磁性納米材料因其較大的比表面積、磁性分離效果等特性，受到越來越多的科研工作者關注[35-37]。目前，使用Fe3O4磁性納米顆粒作為熒光猝滅劑的傳感平臺研究報道較少。本研究以AFM1為目標物，FAM修飾的適配體為識別元件，利用磁性納米材料的猝滅性及磁分離性能，構建基于適配體和磁性納米材料的熒光傳感器。檢測機理如圖1所示，FAM-適配體吸附在Fe3O4表面發生能量共振轉移，造成FAM-適配體的熒光猝滅；當體系中加入AFM1時，FAM-適配體與AFM1結合，FAM-適配體從Fe3O4表面脫附，熒光恢復。

圖1 傳感器的傳感機理Fig.1 Illustration of sensor

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

紫外分光光度計(UV-2450),日本島津公司；熒光分光光度計(F-2500),日本日立公司；臺式高速離心機,德國Eppendorf公司； 透射電子顯微鏡(JEM-1200EX),日本電子株式會社。

FAM-適配體(5′-ACT GCT AGA GAT TTT CCA CAT-3′)，生工生物工程(上海)有限公司；Tris,賽國生物科技有限責任公司；HCl,重慶川東化工有限公司；FeCl3·6H2O，氨水、甲醇、NaCl、乙腈、二氯甲烷,成都市科龍化工有限公司； FeCl2·4H2O,天津市大茂化學試劑廠； AFM1、AFB1、展青霉毒素(PAT)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)、單端孢霉烯(T-2)毒素標準品,美國Sigma公司；純牛奶,購于本地超市，250 mL；營養奶粉,購于本地超市，400 g；脫脂牛奶,購于本地超市，1 L。

1.2 試驗方法

1.2.1 Fe3O4磁性納米顆粒的合成

采用液相共沉淀法制備Fe3O4磁性納米顆粒，將12.16 g FeCl3·6H2O與4.97 g FeCl2·4H2O溶解于200 mL蒸餾水中，劇烈攪拌并緩慢加入氨水，調節pH至9.0左右，于80 ℃熟化30 min得到Fe3O4粒子黑色溶液，用永磁體收集并用超純水和乙醇交替洗滌后冷凍干燥，得到干燥黑色固體粉末。

1.2.2 DNA濃度測定

DNA濃度以單鏈濃度表示，利用紫外-可見分光光度計測定DNA在260 nm處的吸光度，依據朗伯比爾定律(A=εbc)計算得DNA的濃度，配置成100 nmol/L(Tris-HCl pH 8.0)的溶液，于-20 ℃備用。

1.2.3 熒光傳感器對AFM1的檢測

DNA備用溶液解凍后，水浴90 ℃處理10 min，逐漸冷卻至室溫備用。將Fe3O4溶液加入工作液(100 nmol/L DNA溶液)中，再將一定濃度的FAM1加入工作液中作用20 min，利用磁鐵分離。取清液測定熒光光譜(激發波長480 nm)。

1.2.4 實際樣品中AFM1的檢測

向樣品中加入一定量的AFM1，分別配成質量濃度為0.25、0.50、0.75 μg/L的陽性樣本。(1)液體樣品：取5 mL液態樣品(純牛奶和脫脂牛奶)置于離心管中，加入10 mL甲醇和0.5 g NaCl后旋渦振蕩混勻30 s，在37℃下超聲5 min，離心后取上清液過0.22 μm有機微孔濾膜得一定體積微萃取工作液；(2)固體樣品：稱取1 g固體樣品(奶粉)置于離心管中，加入5 mL水，旋渦混勻后，加入10 mL甲醇和0.5 g NaCl并旋渦振蕩混勻30 s，在37 ℃下超聲5 min，離心后取上清液過0.22 μm有機微孔濾膜得一定體積微萃取工作液。將1 mL微萃取工作液、200 μL分散劑乙腈和60 μL萃取劑二氯甲烷加入離心管中，旋渦混勻成均勻的乳濁液，靜置1 min，離心后抽取下層有機相CH2Cl230 μL于試管中，37 ℃水浴氮吹。將干燥物溶解于Tris-HCl緩沖液中制成樣品溶液。然后按照構建的熒光傳感器檢測。另外，根據國家標準采用液相色譜法進行方法對照實驗。

2 結果與討論

2.1 Fe3O4磁性納米顆粒的制備及表征

采用液相共沉淀法制Fe3O4磁性納米顆粒的反應原理如下：

Fe2++2Fe3++8OH-=Fe3O4+4H2O

Fe2+與Fe3+在堿性條件下高溫處理，合成黑色Fe3O4磁性納米顆粒。利用透射電子顯微鏡對其進行表征，具體表征結果如圖2-A所示。結果顯示該方法制備的Fe3O4粒徑約為8～15 nm。圖2-B顯示Fe3O4的磁滯回歸線，說明該Fe3O4具有良好的磁分離能力，能夠快速完成分離效果。

圖2 Fe3O4磁性納米顆粒的透射電鏡圖(A)和磁滯回歸線(B)Fig.2 TEM images(A) and magnetization curves of Fe3O4(B)

2.2 檢測原理

本研究以AFM1為研究對象，構建熒光傳感器。將染料FAM修飾在適配體的一端，其熒光光譜圖如圖3曲線a。加入Fe3O4溶液后，FAM-適配體通過靜電相互作用吸附在Fe3O4表面，Fe3O4與FAM-適配體發生熒光共振能量轉移，熒光信號猝滅，如圖3曲線d所示；當體系中加入AFM1時，FAM-適配體與AFM1識別并形成一定結構，致使FAM-適配體從Fe3O4表面脫附，熒光信號恢復，如圖3中曲線c所示。

a-FAM-適配體;b-FAM-適配體+AFM1;c-FAM-適配體+Fe3O4+AFM1;d-FAM-適配體+Fe3O4;e-AFM1圖3 不同條件下熒光光譜Fig.3 Fluorescence spectra under different conditions

因此，可以通過檢測熒光信號強弱與體系中AFM1的濃度的關系，實現AFM1的定量檢測。

2.3 檢測條件優化

2.3.1 Fe3O4濃度

Fe3O4與FAM-適配體濃度比例在很大程度上影響會影響熒光傳感器的靈敏度，因此考察二者的濃度比顯得十分重要。如圖4所示，含有100 nmol/L的FAM-適配體的緩沖溶液中，熒光強度隨Fe3O4濃度的增加而急劇降低，當Fe3O4質量濃度到達0.35 mg/mL時，熒光強度趨于穩定，當Fe3O4質量濃度繼續增加時，對FAM-適配體熒光的猝滅效果沒有顯著影響，且過量的Fe3O4會降低傳感器的靈敏度。因此，選用0.35 mg/mL作為在后續實驗中Fe3O4濃度。

不同質量濃度Fe3O4下FAM-適配體的熒光光譜(a-0.1、b-0.2、c-0.3、d-0.35、e-0.4、f-0.45、g-0.5、h-0.6、i-0.8 mg/mL)圖4 不同質量濃度Fe3O4對體系熒光強度的影響Fig.4 Effect of different concentrations of Fe3O4 on the fluorescence

2.3.2 熒光恢復時間

實驗中添加AFM1后需要孵育一段時間才能引起熒光信號恢復，本實驗研究了孵育時間0～80 min的熒光恢復情況。如圖5所示，隨著FAM-適配體和AFM1孵育時間的延長，熒光強度逐漸增加，20 min后趨于穩定。因此本研究選擇20 min最佳熒光恢復時間。

插圖：不同孵育時間對應的FAM-適配體(100 nmol/L)的熒光光譜(a-80、b-60、c-50、d-40、e-30、f-20、g-15、h-10、i-5、j-0 min)圖5 不同孵育時間對熒光恢復的影響Fig.5 Effect of incubation time on fluorescence intensity

2.4 熒光傳感器的構建

在上述優化實驗條件下，以AFM1為目標構建熒光傳感器。在熒光傳感器中，加入不同濃度AFM1溶液。研究發現，在一定濃度范圍內，隨著AFM1質量濃度的增大，AFM1與更多的FAM-適配體結合，脫離Fe3O4，熒光強度逐漸恢復，如圖6所示。然而，當AFM1的質量濃度達到一定值時，熒光強度不再明顯增加，達到平衡。熒光強度與AFM1質量濃度范圍在0.05～0.70 μg/L范圍內呈線性關系，檢出限為0.02 μg/L。

AFM1質量濃度a-0.05、b-0.1、c-0.2、d-0.3、e-0.4、f-0.5、g-0.6、h-0.7、i-0.8、j-0.9、k-1.0 μg/L圖6 不同濃度AFM1對所構建傳感器熒光響應變化(A)和熒光與AFM1濃度的線性關系(B)Fig.6 Fluorescence spectrum of sensor with different concentrations of AFM1(A) and relationship between F and concentrations of AFM1(B)

2.5 熒光傳感器選擇性

為了研究熒光傳感器的選擇性，本研究以AFB1、OTA、DON、PAT、T-2為對象考察該傳感器的特異性。結果如圖7所示，當加入0.5 μg/L AFM1時，熒光強度顯著增加。加入10 μg/L對照毒素時熒光強度沒有出現明顯增強。結果表明本研究所構建的傳感器對AFM1有較好的特異性。

圖7 方法選擇性Fig.7 Selectively of sensing systemAFM1質量濃度為0.5 μg/L，其他對照毒素質量濃度均為10 μg/L

2.6 實際樣品測定

為了考察傳感器實際測定效果，我們以純牛奶、脫脂牛奶和奶粉作為實際陰性樣品，研究加標回收情況，并用液相色譜法進行對照實驗。結果如表1所示，利用傳感器檢測的加標回收率在82.5%～102.3%的范圍內，這說明該熒光傳感器可用于真實復雜樣品中AFM1的測定。

3 結論

本研究構建一種基于適配體和磁性納米材料的熒光傳感器，可用于高靈敏度、高特異性檢測AFM1。在最優條件下，傳感器的線性范圍0.05～0.70 μg/L，檢測限為0.02 μg/L。且在實際樣品檢測中同樣表現出較好的效果，說明本檢測方法在食品安全檢測中具有較強的實用性。為開發快速、靈敏和高選擇性的食品安全生物傳感器開辟了新的途徑。

表1 實際樣品加標回收率(n=3)Table 1 Real sample spike recovery (n=3)