伏立諾他協同PI3K抑制劑NVP-BEZ235誘導Jurkat細胞凋亡

陳明　李君君　肖紅　黃力君

[摘要] 目的 探討伏立諾他聯合PI3K抑制劑NVP-BEZ235對Jurkat細胞凋亡的影響，并探討其作用機制。 方法 體外培養Jurkat細胞，用不同濃度伏立諾他或（和）NVP-BEZ235孵育后，采用MTS觀察兩者單獨用藥或聯合用藥對細胞的增殖的影響，流式細胞術檢測細胞凋亡;Western blot檢測PI3K/Akt磷酸化及Bim1表達。 結果 0.12、0.24、0.36、0.48和0.60 μmol/L伏立諾他和6、12、18、24、30 nmol/L NVP-BEZ235對Jurkat細胞的生長增殖具有協同作用。伏立諾他或（和）NVP-BEZ235也可促進Jurkat細胞凋亡，并抑制PI3K/Akt磷酸化，上調Bim1的表達。 結論 伏立諾他對PI3K抑制劑NVP-BEZ235抑制Jurkat細胞生長具有協同作用，并能誘導Jurkat細胞凋亡，其機制與影響Bim1有關。

[關鍵詞] 伏立諾他;急性T淋巴細胞白血病;PI3K抑制劑;NVP-BEZ235;Jurkat細胞凋亡

[中圖分類號] R737.9? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）02-0029-03

急性T淋巴細胞白血病（acute T lymphoblastic leukemia，T-ALL）是一種好發于兒童和成人的造血系統惡性腫瘤，其發病率低，預后差。因此，進一步闡明T-ALL的癌變環節，尋找有效的分子靶點是當前提高T-ALL治愈率的首要任務。研究表明，PI3K/Akt信號傳導通路在細胞生長、增殖、凋亡全過程起著重要的調控作用，在T-ALL中，PI3K/Ak往往異常激活[1]，同時，也與血液系統腫瘤的耐藥有關[2]。而采用PI3K抑制劑處理后，可誘導其周期阻滯和凋亡[3]。這表明針對PI3K/Akt的靶向治療，則可有效延緩腫瘤的發生發展。NVP-BEZ235是一種新型PI3K抑制劑。近年來，組蛋白去乙酰化酶抑制劑（histone deacetylase inhibitors，HDACi）在腫瘤的治療中受到廣泛關注，并可增強多種抗腫瘤藥物的活性[4，5]。本研究擬探討新型HDACi伏立諾他聯合NVP-BEZ235對A-TLL細胞增殖的影響，并探討其機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人T細胞白血病Jurkat來自中國典型培養物保存中心。MTS試劑盒購自Promega，NVP-BEZ235、伏立諾他購自Merck。鼠抗人抗體β-actin抗體、鼠抗人Bim1抗體購自Santa Cruz。凋亡檢測試劑盒購自江蘇碧云天。

1.2 細胞培養與活性檢測

細胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、0.1 g/L鏈霉素的RPMI-1640培養基，于37℃、5%CO2的恒溫培養箱中培養。以每孔約2500個細胞接種在96孔板中，24 h后，細胞用0.12、0.24、0.36、0.48和0.60 μmol/L伏立諾他和6、12、18、24、30 nmol/L NVP-BEZ235處理72 h。根據試劑盒的說明，在酶標儀上570 nm處讀取吸光度。根據參考文獻提供的方法計算藥物聯合指數（CI）值：CI=1，疊加;CI<1，協同;CI>1，拮抗[6]。

1.3 Western blot檢測蛋白表達及磷酸化

收集處理后的細胞，加入蛋白提取試劑充分裂解。蛋白提取物以14 000 r/min離心15 min后，在變性聚丙烯酰胺凝膠上分離總蛋白，并轉移至硝酸纖維素膜上。用含5%脫脂奶粉的TBST封閉后，與相應的一抗4℃溫育過夜。最后用辣根過氧化物酶標記的二抗在室溫下孵育，化學發光、顯影。

1.4 細胞凋亡的檢測

培養3×105個細胞24 h，用0.48 μmol/L伏立諾他或（和）24.0 nmol/L NVP-BEZ235處理細胞48 h。每次大約測定100 000個細胞。用流式細胞儀測定細胞的凋亡率。

1.5 統計學方法

所有數據重復3次，用SPSS 18.0統計學軟件進行數據分析，所有數據以均數±標準差（x±s）表示，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）或t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度伏立諾他和NVP-BEZ235對Jurkat細胞生長增殖的影響

6～30 nmol/L NVP-BEZ235單獨處理Jurkat細胞72 h后，隨著其濃度的遞增，細胞抑制率逐漸增高。0.12～0.60 μmol/L 伏立諾他處理也得到了類似的效果。但聯合用藥后，隨著兩者濃度的遞增，細胞生長得到了進一步抑制。通過計算兩者的聯合指數CI后顯示，0.12～0.60 μmol/L伏立諾他和6～30 nmol/L NVP-BEZ235對抑制Jurkat細胞的生長增殖具有協同作用（CI<1）。見圖1。

2.2 不同濃度伏立諾他和NVP-BEZ235對Jurkat細胞凋亡的影響

對照組細胞凋亡率為（3.51±1.45）%，24 nmol/L NVP-BEZ235處理48 h后凋亡率為（17.92±3.21）%，0.36 μmol/L伏立諾他處理后凋亡率為（14.73±2.61）%，但伏立諾他和NVP-BEZ235聯合用藥后，凋亡率為（31.59±3.47）%，與單純NVP-BEZ235或伏立諾他相比，差異有統計學意義（P<0.05）。

2.3 伏立諾他和NVP-BEZ235對PI3K/Akt磷酸化的影響

Jurkat細胞中Akt的磷酸化水平較高，相對灰度值為（0.970±0.070），采用NVP-BEZ235處理后，Akt的磷酸化水平明顯降低[灰度值為（0.610±0.040）]。單獨的伏立諾他處理也能在一定程度上抑制Akt的磷酸化[灰度值為（0.340±0.010）]，但兩者聯合使用后，Akt的磷酸化水平進一步降低[灰度值為（0.015±0.050）]，見圖2。

2.4 伏立諾他聯合NVP-BEZ235對Bim1表達的影響

Western blot結果顯示，采用NVP-BEZ235或伏立諾他處理后Bim1蛋白表達水平均有所增多，相對灰度值分別為（0.28±0.02）和（0.25±0.03），兩者聯合使用后，其灰度值降低至（0.57±0.08），見圖3。

3討論

PI3K/Akt信號傳導通路與白血病、淋巴瘤等血液系統腫瘤亦密切相關[7]。Akt的異常活化預示著預后不良[7]。NVP-BEZ235主要選擇性阻斷PI3K的催化亞基p110α和p110γ的活性，不但可抑制乳腺癌細胞的生長，也能抑制急性淋巴細胞白血病細胞增殖[8]，同時對某些抗腫瘤藥物如阿霉素、硼替佐米等藥物也具有協同效應[9，10]。

腫瘤細胞的生物學行為也不是某一條信號通路單獨作用的結果，往往受多重調控機制的相互影響、相互協調。因此，多種具有不同作用機制的藥物聯合應用是改善治療效果的重要途徑[11]。從流式細胞術結果可知，與對照組相比，伏立諾他、NVP-BEZ235均能上調凋亡細胞的比例，而伏立諾他和NVP-BEZ235聯合使用后可進一步促進細胞凋亡。這表明伏立諾他聯合NVP-BEZ235不但可抑制Jurkat細胞增殖，同時可加速其凋亡進程。

Bim1是Bcl-2家族僅含BH3區的亞家族成員[12]，在腫瘤的發生發展過程中也發揮重要作用，如采用RNA干擾沉默乳腺癌細胞Bim1表達后，可顯著削弱紫杉醇誘導其凋亡[13，14]。在各種藥物所致的腫瘤細胞凋亡中，Bim1表達顯著增高[15]。表明Bim1參與了伏立諾他和NVP-BEZ235的促凋亡過程。

綜上所述，伏立諾他和NVP-BEZ235聯合使用可抑制Jurkat細胞的生長，二者具有協同效應。兩者可下調Jurkat細胞中PI3K/Akt的活性，隨后可上調促凋亡分子Bim1的表達而誘導凋亡的發生。但伏立諾他和NVP-BEZ235的協同作用機制比較復雜，是否還存在其他的分子機制，仍有待進一步研究。

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（收稿日期：2018-09-11）