銅和鎘對草魚腎臟中3種白細胞介素基因表達的影響

江紅霞，凌潔彬，葉凱甲，李學軍

( 河南師范大學 水產學院，河南 新鄉 453007 )

隨著工農業的發展，大量的重金屬廢棄物流入河流、湖泊和水庫等水域中，對水域生態環境造成了嚴重的污染。在水環境中，重金屬離子先富集于底泥中，然后被浮游生物富集，再通過食物鏈進入魚體大量蓄積，并最終進入人體，對人體的生長發育造成危害，甚至危及人類的生命安全。為保護水生態環境，并最終保護人類的健康，研究重金屬對魚類的毒性作用具有非常重要的意義。重金屬銅(Cu)是魚類必需的微量元素之一，也是水產養殖中的常用藥物成分，但過量的銅又對魚類有毒害作用，會損傷魚類的神經生理功能，破壞嗅覺器官的結構以及內分泌等[1-2]。重金屬鎘(Cd)是生物機體非必需元素之一，其毒性極強，痕量鎘的短期脅迫就可對魚類產生毒性效應及其他生物學效應，導致魚類各組織器官出現損害，從而對其生長發育及生殖造成影響[3-4]。

草魚(Ctenopharyngodonidellus)是我國特有的淡水性魚類，為我國四大家魚之一，是人工養殖的主要種類之一，每年產量居于世界前列。目前有關草魚的研究主要集中在營養價值、轉基因抗病、人工繁殖、疾病防治等方面，有關養殖水環境重金屬污染對草魚的毒性效應的研究也有較多報道[5-9]，但水環境重金屬銅和鎘對草魚免疫系統的破壞以及對其免疫基因表達的影響均未見報道。筆者主要研究水體中不同含量的Cu2+和Cd2+暴露對草魚腎臟組織中3種免疫基因——白細胞介素-1β、白細胞介素-8和白細胞介素-10基因表達的影響，以期為研究重金屬對魚類的免疫毒性機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及飼養管理

試驗魚購自新鄉市水產市場，體長(8.0±1.0) cm、體質量(10.0±1.0) g，實驗室暫養7 d后進行試驗。試驗容器為100 cm×50 cm×40 cm的200 L塑料水箱，每箱放水100 L，放魚10尾。試驗期間使用小型增氧機增氧，溶解氧>9 mg/L，光暗周期為12L∶12D，水溫為(26±2) ℃，pH 7～8。每日投喂市售商品飼料1～2次，并及時清除殘餌及糞便。

1.2 重金屬處理

將分析純CuSO4·5H2O和CdCl2·2.5H2O用去離子水配制成1 g/L的母液。按照國家漁業水質標準中Cu2+的質量濃度≤0.01 mg/L以及Cd2+的質量濃度≤0.005 mg/L，重金屬Cu2+和Cd2+分別設置了5個質量濃度梯度。Cu2+的質量濃度梯度分別0.10、0.20、0.40、0.60、0.80 mg/L(依次為國家漁業水質標準允許質量濃度的10、20、40、60、80倍)；Cd2+的質量濃度梯度分別為0.05、0.10、0.20、0.30、0.40 mg/L(依次為國家漁業水質標準允許質量濃度的10、20、40、60、80倍)。對照組中不添加CuSO4·5H2O和CdCl2·2.5H2O，Cu2+和Cd2+的質量濃度均以0.00 mg/L計。試驗期間，日換水1次，使Cu2+和Cd2+的質量濃度保持穩定。并分別于暴露2、4、6 d和8 d后在每個處理組和對照組中隨機采集5尾試驗魚，冰盤解剖，取出草魚完整的腎臟(包括頭腎和中腎)，液氮迅速冷凍后置于冰箱-80 ℃保存。

1.3 RNA提取

按試劑盒Total RNA kit Ⅱ(Omega 公司)的說明書提取各處理組草魚腎臟組織的總RNA。利用NanoDrop 2000c微量紫外分光光度計(Thermo，美國)測定RNA的含量和純度，并利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。

1.4 實時熒光定量PCR

使用PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)試劑盒對各樣品的總RNA進行反轉錄反應。將反轉成的第一鏈cDNA置于-20 ℃保存。采用Primer Premier 5.0軟件設計用于實時熒光定量PCR的特異性引物(表1)，引物設計所依據的基因模板序列來源于美國國立生物技術信息中心cDNA數據庫。以β-肌動蛋白基因作為內參基因，使用CFX96實時熒光PCR檢測系統(Bio-Rad，USA)和SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa，大連)試劑進行實時熒光定量PCR。PCR反應體系(25 μL)為：SYBR?Premix Ex Taq Ⅱ 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。反應程序為：95 ℃預變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個循環。每個樣本設置3個重復，依據2-ΔΔCt法分析試驗樣本中3種白細胞介素基因的相對表達量。

1.5 數據處理

試驗數據以平均值±標準差表示, 采用單因素方差分析進行統計學檢驗, 利用SPSS 20.0軟件進行數據的統計分析。統計學顯著性水平設定為0.05。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

注：引物名稱中IL為白細胞介素，β-actin為β-肌動蛋白.

2 結 果

2.1 銅和鎘對草魚腎臟中白細胞介素-1β基因表達的影響

在0.80 mg/L Cu2+暴露下，8 d暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-1β基因表達量顯著高于2 d暴露組(P<0.05)；在其他各質量濃度的Cu2+暴露下，2、4、6、8 d暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-1β基因表達量均無顯著差異(P>0.05)(圖1a)。在6 d時，0.40、0.60 mg/L暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-1β基因表達量顯著高于對照組(P<0.05)；在8 d時，0.60、0.80 mg/L Cu2+暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-1β基因表達量顯著高于對照組(P<0.05)；在2、4 d時，各質量濃度Cu2+暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-1β基因表達量與對照組相比均無顯著差異(P>0.05)。

在0.05 mg/L Cd2+暴露下，8 d暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-1β基因表達量顯著高于4 d暴露組(P<0.05)；在0.20、0.30、0.40 mg/L Cd2+暴露下，8 d暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-1β基因表達量顯著高于2、4、6 d暴露組(P<0.05)；在0.10 mg/L Cd2+暴露下，2、4、6、8 d暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-1β基因表達量均無顯著差異(P>0.05)(圖1b)。在6 d時，0.40 mg/L Cd2+暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-1β基因表達量顯著高于對照組(P<0.05)；在8 d時，0.20、0.30、0.40 mg/L Cd2+暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-1β基因表達量均顯著高于對照組(P<0.05)；在2、4 d時，各質量濃度Cd2+暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-1β基因表達量與對照組相比均無顯著差異(P>0.05)。

圖1 不同質量濃度Cu2+和Cd2+暴露對草魚腎臟中白細胞介素-1β 基因表達的影響不同小寫字母代表同一暴露質量濃度的不同暴露時間組之間差異顯著(P<0.05)，相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)；*代表同一暴露時間的不同暴露質量濃度組與對照組相比差異顯著(P<0.05).其他圖同.

2.2 銅和鎘對草魚腎臟中白細胞介素-8基因表達的影響

在0.10 mg/L Cu2+暴露下，8 d暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-8基因表達量顯著高于2 d暴露組(P<0.05)；在0.40 mg/L Cu2+暴露下，8 d暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-8基因表達量顯著高于2、4、6 d暴露組(P<0.05)；在0.60、0.80 mg/L Cu2+暴露下，4、6、8 d暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-8基因表達量顯著高于2 d暴露組(P<0.05)；在0.20 mg/L Cu2+暴露下，2、4、6、8 d暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-8基因表達量均無顯著差異(P>0.05)(圖2a)。在4、6 d時，0.60、0.80 mg/L Cu2+暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-8基因表達量均顯著高于對照組(P<0.05)；在8 d時，0.40、0.60、0.80 mg/L Cu2+暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-8基因表達量均顯著高于對照組(P<0.05)。

在0.05 mg/L Cd2+暴露下，8 d暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-8基因表達量顯著高于4 d暴露組(P<0.05)；在0.10 mg/L Cd2+暴露下，6、8 d暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-8基因表達量顯著高于2、4 d暴露組(P<0.05)；在0.20、0.30 mg/L Cd2+暴露下，6 d暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-8基因表達量顯著高于2、4 d暴露組(P<0.05)；在0.40 mg/L Cd2+暴露下，2、4、6、8 d暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-8基因表達量均無顯著差異(P>0.05)(圖2b)。在2、4 d時，0.30、0.40 mg/L Cd2+暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-8基因表達量均顯著高于對照組(P<0.05)；在6、8 d時，0.05、0.10、0.20、0.30、0.40 mg/L Cd2+暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-8基因表達量均顯著高于對照組(P<0.05)。

圖2 不同質量濃度Cu2+和Cd2+暴露對草魚腎臟中白細胞介素-8基因表達的影響

2.3 銅和鎘對草魚腎臟中白細胞介素-10基因表達的影響

在0.60 mg/L Cu2+暴露下，8 d暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-10基因表達量顯著高于2、4、6 d暴露組(P<0.05)；在0.80 mg/L Cu2+暴露下，6、8 d暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-10基因表達量顯著高于2 d暴露組(P<0.05)；0.10、0.20、0.40 mg/L Cu2+暴露下，2、4、6、8 d暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-10基因表達量均無顯著差異(P>0.05)(圖3a)。在6 d時，0.80 mg/L Cu2+暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-10基因表達量顯著高于對照組(P<0.05)；在8 d時，0.60、0.80 mg/L Cu2+暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-10基因表達量顯著高于對照組(P<0.05)；在2、4 d時，各質量濃度Cu2+暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-10基因表達量與對照組相比均無顯著差異(P>0.05)。

圖3 不同質量濃度Cu2+和Cd2+暴露對草魚腎臟中白細胞介素-10基因表達的影響

在0.20 mg/L Cd2+暴露下，8 d暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-10基因表達量顯著高于2、4 d暴露組(P<0.05)；在0.30、0.40 mg/L Cd2+暴露下，6 d暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-10基因表達量均顯著高于2、4、8 d暴露組(P<0.05)；在0.05、0.10 mg/L Cd2+暴露下，2、4、6、8 d暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-10基因表達量均無顯著差異(P>0.05)(圖3b)。在6、8 d時，0.20、0.30、0.40 mg/L Cd2+暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-10基因表達量均顯著高于對照組(P<0.05)；在2、4 d時，各質量濃度Cd2+暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-10基因表達量與對照組相比均無顯著差異(P>0.05)。

3 討 論

近年來，水產養殖業暴發性病害的相繼發生引起了養殖魚類的大規模死亡，造成了漁業生產的巨大經濟損失。病害發生的原因之一就是工農業生產過程中排放的大量污水使得養殖水域污染不斷加重，水環境質量逐年惡化。因此，研究水體污染物包括水環境中的重金屬對養殖魚類的免疫毒性及其毒性機制，對養殖水環境保護和魚類病害防治均有重要的意義。腎臟是魚類重要的免疫器官，外界病原和污染物的刺激會使腎臟產生相應的免疫細胞和免疫因子，從而對魚體進行免疫調節。白細胞介素是魚體中的一類重要的免疫因子，它是由多種細胞產生并作用于多種細胞的一類細胞因子，由于最初是由白細胞產生又在白細胞間發揮作用，所以由此得名。迄今，已發現有33種白細胞介素參與免疫調節、造血、炎癥反應等過程[10]。近年來，白細胞介素作為魚類重要的免疫細胞因子，已得到廣泛研究，相繼在各種魚類中克隆得到了白細胞介素-1[11]、白細胞介素-2[12]、白細胞介素-4[13]、白細胞介素-8[14]和白細胞介素-10[15]的全長基因，這些白細胞介素在魚類的免疫調節中均發揮著重要的作用。

3.1 草魚腎臟中白細胞介素-1β基因在銅和鎘脅迫下的表達變化

白細胞介素-1是在局部和全身炎癥反應中起關鍵作用的細胞因子，是重要的炎癥和一般起始反應的介質，在級聯反應中可調控其他細胞因子的表達。在哺乳動物中已發現11種白細胞介素-1家族成員，包括白細胞介素-1α、白細胞介素-1β、白細胞介素-1ra、白細胞介素-18、白細胞介素-1F5和白細胞介素-33等[16]，但目前在魚類中只發現了白細胞介素-1β和白細胞介素-18[17]。本試驗研究了Cu2+和Cd2+暴露對草魚腎臟白細胞介素-1β基因表達的影響。結果發現，當Cu2+和Cd2+暴露到第8 d時，0.60、0.80 mg/L Cu2+暴露組、0.20、0.30、0.40 mg/L Cd2+暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-1β基因表達量均顯著高于對照組(P<0.05)，說明長時間高質量濃度的Cu2+和Cd2+暴露，對草魚的腎臟造成了一定的損傷，引起了草魚腎臟細胞的炎癥反應，其炎癥細胞因子白細胞介素-1β的基因表達量顯著升高，從而促進腎臟細胞的免疫調節。

3.2 草魚腎臟中白細胞介素-8基因在銅和鎘脅迫下的表達變化

白細胞介素-8是典型的促炎癥因子，也是一種CXC型趨化性細胞因子，對中性粒細胞、嗜堿性粒細胞和T細胞有趨化作用，同時具有刺激血管生成、促有絲分裂和免疫調節等作用[18]。白細胞介素-8調節炎癥反應，對感染組織有一定的恢復作用[19]。本試驗中，草魚腎臟中白細胞介素-8基因表達量在較高質量濃度和較長時間的Cu2+暴露下(0.40 mg/L，8 d;0.60 mg/L,4、6、8 d;0.80 mg/L,4、6、8 d)顯著高于對照組(P<0.05)，而在Cd2+暴露下，在暴露時間較長(6、8 d)時，各質量濃度組的白細胞介素-8基因表達量均顯著高于對照組(P<0.05)，但在高質量濃度Cd2+(0.30、0.40 mg/L)暴露下，在僅暴露2、4 d時，白細胞介素-8基因表達量就已顯著高于對照組(P<0.05)。以上結果說明，白細胞介素-8基因的表達對Cd2+的暴露要比對Cu2+的暴露更加敏感，這可能是由于Cd2+對草魚的毒性要比Cu2+強，Cd2+的暴露比Cu2+暴露對草魚腎臟的損傷更快更嚴重，從而引起草魚腎臟細胞更加靈敏的炎癥反應。

3.3 草魚腎臟中白細胞介素-10基因在銅和鎘脅迫下的表達變化

白細胞介素-10又稱細胞因子合成抑制因子，參與炎癥反應并能緩解炎癥，對機體具有保護作用，在硬骨魚中具有免疫調節作用[20]。白細胞介素-10 mRNA的表達增加可抑制炎癥反應，緩解炎癥疾病，有助于治療炎癥[21]。本試驗中，高質量濃度和長時間的Cu2+暴露(0.60 mg/L,8 d；0.80 mg/L,6、8 d)，以及高質量濃度(0.20、0.30、0.40 mg/L)和長時間(6、8 d)的Cd2+暴露均使草魚腎臟中白細胞介素-10基因表達量顯著高于對照組(P<0.05)，這可能是腎臟細胞為了抑制和緩解Cu2+、Cd2+暴露對腎臟所造成的炎癥反應而大量合成白細胞介素-10所致。

3.4 草魚腎臟中白細胞介素基因表達量與銅和鎘的脅迫時間的關系

在本研究中，在0.80 mg/L Cu2+，0.30、0.40 mg/L Cd2+暴露下的草魚腎臟中白細胞介素-1β基因表達量，以及在0.60、0.80 mg/L Cu2+暴露下的草魚腎臟中白細胞介素-8和白細胞介素-10基因表達量，均隨著暴露時間的增加而逐漸升高，在第8 d時達到最大值，且在第8 d時的基因表達量均顯著高于第2 d時(P<0.05)。這些結果說明在高質量濃度的Cu2+暴露下的白細胞介素-1β、白細胞介素-8和白細胞介素-10基因表達量，以及在高質量濃度Cd2+暴露下的白細胞介素-1β基因表達量，均與暴露時間呈現出一定的正相關關系，其表達量具有一定的時間依賴性。這可能是因為Cu2+和Cd2+暴露的時間越長，草魚腎臟受到的損傷越嚴重，其炎癥反應也越強烈，腎臟細胞產生的各種促炎癥因子和細胞因子合成抑制因子也越多。

4 結 論

總之，本研究利用實時熒光定量PCR初步分析了草魚在水體銅和鎘脅迫下，其腎臟中的免疫細胞因子——白細胞介素-1β、白細胞介素-8和白細胞介素-10的基因表達量的變化，試驗結果表明，高質量濃度和長時間的Cu2+和Cd2+暴露會使草魚腎臟中的白細胞介素-1β、白細胞介素-8和白細胞介素-10基因表達量顯著增加，且高質量濃度的Cu2+暴露下的白細胞介素-1β、白細胞介素-8和白細胞介素-10以及高質量濃度Cd2+暴露下的白細胞介素-1β基因表達量具有一定的時間依賴性。本研究結果為后續深入研究重金屬對魚類的免疫毒性機制，提高環境污染條件下的魚類抗病力奠定了基礎。