杜仲內生拮抗細菌DZSY21誘導玉米抗病基因表達變化的轉錄組學研究

王 其，陳小潔，顧雙月，張欣悅，杭天露，丁 婷

(安徽農業(yè)大學 植物保護學院，安徽 合肥 230036)

植物內生細菌是指植物內生菌中的細菌，絕大部分內生細菌可與寄主植物建立和諧共生的關系且不會對寄主植物造成實質性危害[1]。相關報道表明，在植物病蟲害防治方面應用植物內生細菌可有效增強植物的抗病性[2-4]。目前，有關內生細菌增強玉米抗病性的研究主要集中在病害脅迫下玉米的生理特性如苯丙氨酸解氨酶(PAL)、過氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)等[5-6]方面，利用分子生物學手段來研究玉米應答內生細菌的抗病相關轉錄調控鮮有報道。

轉錄組學研究作為一種高通量的研究方法，能夠從整體上分析植物在應答逆境脅迫過程中所有mRNA的變化情況。隨著這項技術的不斷發(fā)展完善，目前已通過轉錄組測序技術從擬南芥[7-8]、水稻[9]、玉米[10]、油菜[11]等植物中鑒定了大量的逆境脅迫應答基因，并對其抗逆作用機理進行了探討。前期研究發(fā)現，杜仲內生拮抗細菌DZSY21可在玉米中穩(wěn)定定殖并增強玉米植株的抗病能力[3]，在此基礎上，本研究運用轉錄組測序技術，比較分析玉米在噴施杜仲內生拮抗細菌后不同時間段內基因的表達情況，并對其進行生物信息學分析，為進一步尋找玉米抗病基因及其抗病機理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌種來源、菌懸液制備

試驗菌株為前期研究中獲得的一株在離體條件下對玉米小斑病菌、玉米紋枯病菌具有較好抑菌活性的杜仲內生拮抗細菌[3，6]，編號為DZSY21 (BacillussubtilisDZSY21)，NCBI登錄號為KP777560，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(保藏編號：CGMCCNO.11749)。

菌株DZSY21接種于牛肉膏蛋白胨(NA)液體培養(yǎng)基中，搖床轉速為160 r·min-1，于37 ℃培養(yǎng)8～10 h，調節(jié)發(fā)酵液中DZSY21的菌體濃度至1.0×106CFU·mL-1，獲得DZSY21菌懸液。

1.2 供試玉米品種與栽培方式

供試玉米品種為自交系昌7-2，選取籽粒飽滿、大小一致的種子，催芽后播種在安徽農業(yè)大學教學實習基地中，種植方式為壟栽，壟面寬70 cm，壟距30 cm，株距30 cm，行距60 cm，每壟栽植20粒健康玉米種子，共栽植2壟。待玉米長至大喇叭口期時選取長勢相當的玉米植株，在健康葉片上噴灑DZSY21菌懸液(含菌量為1.0×106CFU·mL-1)，每個葉片表面噴灑5 mL，每個處理5株玉米，3個重復。在DZSY21菌懸液處理0、12和24 h時選取玉米葉片樣品，經液氮速凍后置于-70 ℃保存，用于RNA的提取。DZSY21菌懸液處理0、12、24 h時的玉米樣品分別記為T01、T02和T03。

1.3 葉片總RNA提取、文庫構建及轉錄組測序

玉米總RNA提取方法參照Invitrogen公司的Trizol Reagent說明書進行。使用Nanodrop檢測RNA的純度(D260/D280)和濃度。RNA樣品檢測合格后，進行文庫構建。cDNA文庫構建方法參照RNA-Seq文庫構建試劑盒(Illumina公司，美國)說明書進行。文庫構建完成后，由北京百邁克生物科技有限公司完成測序，測序平臺為Illumina HiSeq。

1.4 測序數據處理與注釋

測序產出大量高質量的原始數據(raw data)，為保證測序分析的質量，對原始數據文件進行處理，去除含有接頭的Reads和低質量的Reads(包括去除N的比例大于10%的Reads；去除質量值Q≤10的堿基數占整條Read的50%以上的Reads)之后，獲得高質量的Clean Data。利用TopHat2[12]將Clean Reads與玉米B73參考基因組進行序列比對，獲取在玉米B73參考基因組或基因上的位置信息，以及測序樣品特有的序列特征信息。利用Cufflinks軟件的Cuffquant和Cuffnorm組件，通過Mapped Reads(比對到指定的參考基因組上的Reads)在基因上的位置信息，對轉錄本和基因的表達水平進行定量，使用FPKM[13]作為基因表達水平的衡量指標。

1.5 差異表達基因篩選

使用DESeq[14]軟件進行樣品組間的差異表達分析，符合錯誤發(fā)現率(false discovery rate，FDR)小于0.01且差異倍數(fold change)在2倍及以上的基因被定義為樣品間的差異表達基因(DEG)。

1.6 抗病顯著差異表達基因篩選及分析

基于篩選的差異表達基因，使用BLAST[15]軟件將差異表達的基因與NR[16]、Swiss-Prot[17]、GO[18]和KEGG[19]等數據庫進行序列比對，獲得差異表達基因的注釋信息。根據注釋信息篩選抗病相關基因，再根據其注釋信息進行GO和KEGG等相關分析。

1.7 qRT-PCR分析

對于保留的另一份樣品進行RNA提取，挑選10個(表1)DEG進行驗證。所選反轉錄試劑為Prime ScriptTMRT reagent Kit RT with gDNA Eraser (Perfect Real Time)[寶日醫(yī)生物技術(北京)有限公司]，熒光定量試劑盒為SYBR?Premix ExTaqTMII(Tli RNaseH Plus)[寶日醫(yī)生物技術(北京)有限公司]，qRT-PCR體系(20 μL)：SYBR Green混合物12.5 μL，模板cDNA 2 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 4 μL。反應程序為95 ℃預變性30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。ZmActin為內參基因，引物設計采用軟件Primer Premier 6.0。實驗包含兩次生物學重復，每次生物學重復進行3次技術重復。結果使用ABIPRISM7300 系統(tǒng)相對定量分析軟件進行分析，采用2-ΔΔCt法計算。

2 結果與分析

2.1 測序數據結果

DZSY21菌懸液處理0 h(T01)、12 h(T02)、24 h(T03)的3個樣品的轉錄組測序結果如表2所示，上述3個處理分別獲得25 143 751、35 383 050、35 383 050條Raw Reads，經過對原始數據的整理和篩選分析，總共獲得21.93 Gb的Clean Data，其中各樣品Clean Reads分別是24 188 231、34 070 148和29 095 437；各樣品的Clean Data均達到6.08 Gb。 GC含量分別為58.00%、56.11%和56.93%；Q30堿基百分比均在87.03%及以上，滿足后續(xù)分析要求。

2.2 差異表達基因篩選

根據Fold change≥2且FDR<0.01的篩選標準，以DZSY21菌懸液處理0 h(T01)樣品為參照，比對發(fā)現DZSY21菌懸液處理玉米葉片12 h(T02)時，T01與T02之間有2 413個差異表達基因，其中1 278個DEGs為上調表達，1 135個DEGs下調表達；DZSY21菌懸液處理玉米葉片24 h(T03)時，T01與T03之間有737個差異表達基因，其中538個DEGs為上調表達，199個DEGs為下調表達，如圖1所示，在DZSY21菌懸液處理后，玉米葉片中上調基因數量明顯多于下調基因數量。

表1qRT-PCR所用引物序列

Table1Primers used in qRT-PCR

表2測序數據統(tǒng)計

Table2Sequencing data statistics

樣品SamplesRawReadsCleanReadsGC含量GC content/%≥Q30/%T01251437512418823158.0087.03T02353830503407014856.1187.32T03353830502909543756.9387.08

Raw Reads，Raw Data中pair-end Reads總數；Clean Reads，Clean Data中pair-end Reads總數；GC含量，Clean Data中G和C兩種堿基占總堿基的百分比；≥Q30，Clean Data質量值大于或等于30的堿基所占的百分比。

Raw Reads， The number of pair-end Reads in Raw Data; Clean Reads， The number of pair-end Reads in Clean Data; GC content， The percentage of G and C in the total base in Clean Data; ≥Q30， The percentage of the base whose quality value was more than or equal to 30 in Clean Data.

2.3 抗病差異表達基因篩選

在獲得差異表達基因(DEGs)的基礎上，依據差異表達基因(DEGs)的功能注釋，結合已有的差異表達基因(DEGs)的功能報道，以抗病功能為篩選指標，從差異表達基因中篩選與抗病相關的基因，在處理12 h的樣品中，篩選得到218個與抗病相關的基因；處理24 h的樣品中，獲得71個基因；其中，兩個不同時間段獲得的抗病相關基因中有重復基因23個，最終，通過對12 h和24 h兩個樣品的分析，共獲得267個抗病相關基因，這些基因主要涉及32類抗病相關途徑，結果如表3顯示。

圖1 DZSY21處理12 h和24 h后玉米葉片中差異表達基因的統(tǒng)計Fig.1 Statistic of DEGs in maize leaves at 12 h and 24 h in DZSY21 treatments

以DZSY21菌懸液處理0 h為對照，結果顯示：處理12 h時與抗性相關的差異表達基因共有218個基因，其中130個上調表達，88個下調表達，相關基因主要涉及編碼脂質轉移蛋白(bifunctional inhibitor/lipid-transfer protein)、MATE轉運蛋白(MATE efflux family protein)及LysM受體蛋白激酶(LysM domain receptor-like kinase)等26類抗病相關途徑。處理24 h時，與抗性相關的差異表達基因共有71個基因，其中55個上調表達基因，16個下調表達基因，涉及編碼異黃酮還原酶(isoflavone reductase)、纖維素合成酶(probable cellulose synthase)、苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase)、L-抗壞血酸過氧化物酶(L-ascorbate peroxidase)、GLK轉錄因子(probable transcription factor GLK)及ACC氧化酶(ACC oxidase)等30類抗病途徑。此外，分析發(fā)現，在DZSY21菌懸液處理玉米葉片后12 h和24 h，出現重疊抗病相關差異表達基因23個，具體如表4所示。

2.4 抗病差異表達基因分析

對玉米葉片中抗病相關的差異表達基因進行GO分析，結果(圖2)顯示：在生物學過程(biological process)分類中主要聚集在應激反應(response to stimulus)、代謝過程(metabolic process)和單一生物過程(single-organism process)；在細胞組分(cellular component)分類中主要聚集在細胞器(organelle)、細胞(cell)和細胞部分(cell part)；在分子功能(molecular function)分類中主要聚集在核酸結合轉錄因子活性(nucleic acid binding transcription factor activity)、催化活性(catalytic activity)和結合(binding)。

對玉米葉片中抗病相關的差異表達基因進行KEGG分析，結果(圖3)顯示：T01-VS-T02中有30個抗病相關差異表達基因注釋到9個代謝通路分支中，T01-VS-T03中有18個抗病相關差異表達基因注釋到10個代謝通路分支中。其中主要注釋為谷胱甘肽代謝(glutathione metabolism)、苯丙氨酸代謝(phenylalanine metabolism)和苯丙素生物合成(phenylpropanoid biosynthesis)代謝通路中。

A，復制；B，生長；C，免疫系統(tǒng)進化；D，信號；E，多生物體進程；F，生殖過程；G，細胞組件生物起源；H，定位；I，多細胞生物體進程；J，發(fā)育進程；K，生物調節(jié)；L，響應刺激；M，代謝過程；N，單生物體進程；O，細胞進程；P，大分子復合物；Q，細胞連接；R，胞外區(qū)；S，膜組分；T，細胞器組分；U，膜；V，細胞器；W，細胞；X，細胞部分；Y，轉運蛋白活性；Z，受體活性；AB，分子轉導蛋白活性；AC，核酸結合轉錄因子活性；AD，催化活性；AE，連接；AF，抗氧化活性。A， Reproduction; B， Growth; C， Immune system process; D， Signaling; E， Multi-organism process; F， Reproductive process; G， Cellular component organization or biogenesis; H， Localization; I， Multicellular organismal process; J， Developmental process; K， Biological regulation; L， Response to stimulus; M， Metabolic process; N， Single-organism process; O， Cellular process; P， Macromolecular complex; Q， Cell junction; R， Extracellular region; S， Membrane part; T， Organelle part; U， Membrane; V， Organelle; W， Cell; X， Cell part; Y， Transporter activity; Z， Receptor activity; AB， Molecular transducer activity; AC， Nucleic acid binding transcription factor activity; AD， Catalytic activity; AE， Binding; AF， Antioxidant activity.圖2 抗病相關差異表達基因GO注釋圖Fig.2 GO annotations of disease-associated DEGs

A，自噬調節(jié)；B，植物激素信號轉導；C，RNA運輸；D，氨基酸和核苷酸糖代謝；E，谷胱甘肽代謝；F，苯丙氨酸代謝；G，苯丙氨酸生物合成；H，植物-病原互作；I，植物晝夜節(jié)律；J，ABC轉運蛋白；K，半胱氨酸和蛋氨酸代謝；L，賴氨酸降解；M，抗壞血酸和醛糖代謝。A， Regulation of autophagy; B， Plant hormone signal transduction; C， RNA transport; D， Amino sugar and nucleotide sugar metabolism; E， Glutathione metabolism; F， Phenylalanine metabolism; G， Phenylpropanoid biosynthesis; H， Plant-pathogen interaction; I， Circadian rhythm-plant; J， ABC transporters; K， Cysteine and methionine metabolism; L， Lysine degradation; M， Ascorbate and aldarate metabolism.圖3 抗病相關差異表達基因KEGG注釋圖Fig.3 KEGG annotations of disease-associated DEGs

2.5 qRT-PCR驗證

通過上述抗病基因的篩選，共獲得267個抗病相關基因。任意選取其中的10個基因進行qRT-PCR驗證，結果如圖4所示。將差異表達基因表達趨勢與轉錄組數據的表達趨勢進行比較，發(fā)現兩者趨勢相同，說明了轉錄組數據的準確性。

3 討論

基因調控在植物應答病害脅迫的過程中發(fā)揮重要的作用，在病害脅迫下植物中抗性基因呈現出不同的應答反應模式和表達變化水平。本研究結果表明，內生菌DZSY21引入玉米葉片的不同時間段內可以誘導或抑制不同抗性基因的表達變化。

研究發(fā)現，內生菌DZSY21處理玉米葉片12 h時，涉及編碼脂質相關蛋白、LysM受體蛋白激酶、幾丁質酶、過氧化物酶和VQ-motif家族蛋白等5類蛋白的相關基因僅上調表達；處理玉米葉片24 h時，涉及編碼纖維素合成酶、索馬甜功能域蛋白家族、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、肉桂酰輔酶A還原酶、凝集素蛋白激酶、抗病蛋白、VQ-motif家族蛋白、幾丁質酶、過氧化物酶、UDP-糖基轉移酶、MYB轉錄因子、L-抗壞血酸過氧化物酶、GLK轉錄因子等17類蛋白的相關基因僅上調表達。對比分析發(fā)現，隨著內生菌DZSY21處理時間的延長，編碼脂質相關蛋白和LysM受體蛋白激酶的基因表達逐漸消失，與此同時，編碼植物抗病相關蛋白及酶類的基因則呈顯著上調表達趨勢，推測，編碼抗病相關蛋白及酶類基因的顯著上調表達可能抑制了編碼脂質相關蛋白和LysM受體蛋白激酶等基因的表達，從而出現基因表達消失的現象。此外，研究中發(fā)現，在內生菌DZSY21引入玉米的時間延長24 h，玉米植株中編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶和凝集素蛋白激酶等基因，以及GLK和MYB等轉錄因子家族的轉錄因子均呈上調表達。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶和凝集素蛋白激酶均屬于植物類受體蛋白激酶(RLK)且定位在細胞質膜上，主要通過胞外信號分子與其胞外區(qū)結構域特異結合，結合后激活胞內激酶域而完成跨膜信號的轉導；它可被病原菌的相關分子模式PAMP或MAMP識別，而激活下游的PTI抗性反應[20]，在植物體內參與信號轉導、抗逆反應和病原反應等途徑[21]。本研究中，多種RLK相關基因在DZSY21處理24 h的玉米中上調表達，說明內生菌DZSY21引入玉米，可誘導RLK相關基因的表達，使玉米產生PTI免疫反應，增強其抗病性。GLK作為GARP家族的一類，在水稻、玉米、辣椒等植物中廣泛存在[22]，已有研究表明，GLK可增強擬南芥對禾谷鐮刀菌等病原菌的抗性[23-24]。而MYB類轉錄因子已被證實廣泛參與類黃酮代謝途徑的調控，而類黃酮可在植物受到病原侵染時被誘導合成，是具有廣譜抗菌活性的植物保護素[25]。本試驗中，在生物因子DZSY21的脅迫下，誘導玉米GLK和MYB轉錄因子上調表達，試驗結果與已有的研究報道相一致，可知，GLK和MYB轉錄因子可通過增強玉米對病原菌的抗性以及增加植株體內類黃酮含量等方式提高玉米植株抗病性。

圖4 差異表達基因的qRT-PCR驗證Fig.4 Validation of DEGs data by qRT-PCR

表3抗病相關差異表達基因數量統(tǒng)計信息

Table3Statistic information of disease related DEGs

基因功能Gene functionT01-VS-T02上調Up-regulated下調Down-regulatedT01-VS-T03上調Up-regulated下調Down-regulated脂質轉移蛋白Bifunctional inhibitor/lipid-transfer protein2000異黃酮還原酶Isoflavone reductase0001乙烯響應轉錄因子Ethylene-responsive transcription factor5101纖維素合成酶Probable cellulose synthase0010索馬甜功能域蛋白家族Putative thaumatin domain family protein2110絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Serine/threonine-protein kinase31120肉桂酰輔酶A還原酶Cinnamoyl-CoA reductase2130凝集素蛋白激酶Lectin protein kinase family protein5510枯草桿菌蛋白酶樣蛋白酶Putative subtilase family protein1521抗病蛋白Putative disease resistance protein10180MATE轉運蛋白MATE efflux family protein2100幾丁質酶Chitinase4020過氧化物酶Peroxidase9020谷胱甘肽S-轉移酶Glutathione S-transferase1511富含亮氨酸重復的蛋白激酶家族蛋白2712104Putative leucine-rich repeat receptor-like protein kinase family protein富含半胱氨酸的類受體激酶Cysteine-rich RLK (RECEPTOR-like protein kinase)7331苯丙氨酸解氨酶Phenylalanine ammonia-lyase0001WRKY轉錄因子WRKY transcription factor7311VQ-motif家族蛋白 VQ motif family protein3010UDP-糖基轉移酶UDP-glycosyltransferase4620MYB轉錄因子MYB transcription factor91140L-抗壞血酸過氧化物酶L-ascorbate peroxidase0020lysM受體蛋白激酶LysM domain receptor-like kinase4000

續(xù)表3

表4DZSY21處理玉米不同時間段的重疊抗病相關差異表達基因

Table4Statistic information of common disease releated DEGs after DZSY21 treatment

基因編號Gene ID差異倍數FC(12 h/0 h)差異倍數FC(24 h/0 h)基因功能Gene functionMaize_newGene_25824.214.99抗病蛋白Putative disease resistance proteinGRMZM5G8913715.626.77枯草桿菌蛋白酶樣蛋白酶Putative subtilase family proteinGRMZM5G8700772.16-2.11F-box蛋白F-box domain containing proteinGRMZM2G4686103.523.44富含半胱氨酸的類受體激酶Cysteine-rich RLK (RECEPTOR-like protein kinase)GRMZM2G4559092.776.12抗病蛋白Putative disease resistance proteinGRMZM2G4553215.299.20抗病蛋白Putative disease resistance proteinGRMZM2G441031-7.55-3.55WRKY轉錄因子WRKY transcription factorGRMZM2G4163222.062.04富含半胱氨酸的類受體激酶Cysteine-rich RLK (RECEPTOR-like protein kinase)GRMZM2G4026315.293.54抗病蛋白Putative disease resistance proteinGRMZM2G3612563.082.70ABC轉運蛋白ABC transporter G family memberGRMZM2G3122264.595.17幾丁質酶ChitinaseGRMZM2G3017383.433.38凝集素蛋白激酶Lectin protein kinase family proteinGRMZM2G1591194.345.79MYB轉錄因子MYB transcription factorGRMZM2G1309044.493.83過氧化物酶PeroxidaseGRMZM2G1233143.212.95富含亮氨酸重復的蛋白激酶家族蛋白Putative leucine-rich repeat receptor-like protein kinase family proteinGRMZM2G0563352.422.42UDP-糖基轉移酶 UDP-glycosyltransferaseGRMZM2G055684-4.04-2.25枯草桿菌蛋白酶樣蛋白酶Putative subtilase family proteinGRMZM2G032856-2.72-2.02谷胱甘肽S-轉移酶Glutathione S-transferaseGRMZM2G0131705.949.24抗病蛋白Putative disease resistance proteinGRMZM2G0129262.382.14抗病蛋白Putative disease resistance proteinGRMZM2G0128612.982.83富含亮氨酸重復的蛋白激酶家族蛋白Putative leucine-rich repeat receptor-like protein kinase family proteinAC234526.1_FG0052.642.70肉桂酰輔酶A還原酶Cinnamoyl-CoA reductaseAC204711.3_FG002-2.31-2.66富含亮氨酸重復的蛋白激酶家族蛋白Putative leucine-rich repeat receptor-like protein kinase family protein

本試驗發(fā)現，DZSY21菌株處理24 h，玉米中AP2/EREBP轉錄因子、乙烯響應轉錄因子以及苯丙氨酸解氨酶均呈現負調控現象。AP2/EREBP轉錄因子與植物對逆境脅迫的應答有著密切的關系，根據AP2/EREBP結構域的數量，可以把AP2/EREBP轉錄因子家族分成2個亞族：AP2亞族(具有1個AP2/ERF結構域)和EREBP亞族(具有2個AP2/ERF結構域)。AP2亞族轉錄因子有調控花、胚珠和種子發(fā)育的功能， 而EREBP亞族轉錄因子的主要功能是調節(jié)植物對激素(乙烯和ABA等)、病原和脅迫(低溫、干旱及高鹽)等的應答反應[26]。而乙烯響應轉錄因子大部分屬于ERFs(ethylene responsive factors)轉錄因子家族。ERF轉錄因子在轉錄水平主要通過激活或抑制下游抗病相關基因表達，提高作物抗病性[27]。本研究中的相關AP2/EREBP轉錄因子以及乙烯響應轉錄因子的表達呈下調，說明拮抗菌引入玉米植株，不能誘導寄主植物形成乙烯信號途徑，此結果再次證實了本課題組前期的研究發(fā)現[3]，即拮抗菌株DZSY21引入玉米葉片，可誘導玉米中的水楊酸(SA)和茉莉酸(JA)信號通路。此外，苯丙氨酸解氨酶(PAL)作為苯丙烷類代謝過程的關鍵酶，催化苯丙氨酸向肉桂酸的轉化，促使產生木質素、黃酮類、植物抗毒素等多種次生代謝產物[28]。相關研究表明，PAL的表達和某些功能蛋白的表達呈正相關[28]，如擬南芥中的KFB蛋白能和PAL在植物體內、體外相互作用，KFB蛋白表達的下調直接影響PAL，使其表達下調，從而增加植株體內苯丙素類中間次生代謝物的積累，間接增強植物抗性[29-30]。由此可知，本研究中編碼苯丙氨酸解氨酶的相關基因受到某種蛋白表達的影響而呈下調趨勢，造成苯丙氨酸解氨酶的數量減少，進而增加苯丙素類中間次生代謝物的積累達到抗病的目的。

植物基因數目眾多，因此其調控方式表現出多樣性。從本試驗測序數據分析的結果可以看出，受外源內生拮抗菌DZSY21誘導的玉米在不同時間段，其編碼不同種類的蛋白、酶以及轉錄因子相關的基因上調和下調表達的數目或表達變化程度不同；有的基因家族中既有上調表達也有下調表達，究其原因，這種表達的差異可能是受外源拮抗菌的誘導，植物重新組織和調節(jié)生理生化活動，以提高或改善某些代謝途徑來適應生存環(huán)境的變化，減少傷害[31]。此外，同一玉米品種在不同時間段，所表達的基因也有部分相同，表明其在外界生存環(huán)境變化時，在生長的不同階段植株有某種相同的反應機制，這種機制可能與基礎抗性有關。