葡萄STS基因家族的鑒定與表達分析

陳洪強，夏 惠，王 進，鄧群仙，梁 東，呂秀蘭，*，唐禮平

(1.四川農業大學 園藝學院，四川 成都 611130； 2.廣安市前鋒區農業局，四川 廣安 638019)

芪類化合物是一種重要的植物酚類物質，目前發現該類化合物只存在于少數植物中，如葡萄(Vitisvinifera)、花生(Arachishypogaea)、日本虎杖(Fallopiajaponica)、高粱(Sorghumbicolor)和松類植物(Pinus)[1]等。芪類化合物在植物中主要以白藜蘆醇(resveratrol)及其糖基化、甲基化和氧化形成的衍生物等形式存在[2]。芪類化合物不僅在植物抵御逆境脅迫或病原菌侵染的防御反應中發揮重要作用[3]，而且還具有多種有益于人體健康的生物學活性功能，在抗腫瘤、預防心血管疾病、控制血糖、保護神經系統和抗炎等方面發揮重要作用[4-5]。

芪類化合物的生物合成是通過苯丙氨酸代謝途徑(Phenylpropanoid pathway)進行的。首先是苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonialyase，PAL)作用下生成肉桂酸(cinnamic acid)，之后肉桂酸在肉桂酸-4-羥基化酶(cinnamate 4-hydroxylase，C4H)作用下生成4-香豆酸(4-coumaric acid)，接著4-香豆酸通過4-香豆酰輔酶A連接酶(4-coumarate: CoA ligase，4CL)與泛酰巰基乙胺CoA連接，生成香豆酰CoA(4-coumaroyl-CoA)，最后芪合成酶(stilbene synthases，STS)催化1個4-香豆酰輔酶A和3個丙二酰輔酶A(malonyl-CoA)生成白藜蘆醇[2]。研究表明，在這個途徑中，STS是合成芪類化合物的關鍵酶，該酶屬于Ⅲ型聚酮合酶家族[6]，在大多數合成白藜蘆醇的植物中以基因家族的形式存在。如花生中有2 個STS基因被克隆[7]，歐洲赤松(Pinussylvestris)中發現了4個STS基因[8]，從日本紅松(Pinusdensiflora)中也已獲得了3個STS基因[9]。葡萄中也發現多個STS存在，早期通過Southern-blot試驗證明葡萄基因組中有超過20個STS基因[10]。在黑比諾葡萄(Vitisviniferacv. Pinot noir)基因組測序完成之后，Parage等[11]和Alessandro等[12]分別發現了32個和33個STS基因全長，在毛葡萄(Vitisquinquangularis)品種丹鳳-2中也發現了41個STS基因[13]。

葡萄是一種世界范圍內廣泛種植的水果，葡萄與以葡萄為原料的加工產品是食物中白藜蘆醇類化合物旳主要來源。近十年來，葡萄種植在中國發展很快，目前已形成多個葡萄種植集中區，其中就包括以云南、貴州、廣西和四川為主的西南產區[14]。本研究以四川盆地廣泛種植的夏黑葡萄為試材，對其STS進行了全基因組鑒定，并檢測STS基因家族成員在果實和葉片生長過程的表達特性，為深入研究芪類物質的生物合成奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試材料為四川省崇州市榿泉鎮四川農業大學科研基地4年生夏黑葡萄，單干四主蔓水平棚架，避雨栽培，株行距為1.5 m × 3.0 m。在葡萄謝花后20、30、40、50、60、70、80和90 d收集葡萄果實樣品帶回實驗室。取果皮在液氮中速凍后存于-80 ℃備用。在花后90 d，在結果枝上分別取頂端、中部和基部葉片作為幼葉、成熟葉和衰老葉，液氮速凍后存于-80 ℃備用。

1.2 葡萄STS基因家族鑒定與序列分析

葡萄全基因組數據文件來源于葡萄基因組數據庫(http://genomes.cribi.unipd.it/grape和https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)。在Pfam(http://pfam.xfam.org)中獲取STS基因家族序列特征文件(PF00195和PF02797)，使用HMMER軟件并以PF00195和PF02797為種子序列檢索比對葡萄基因組中的氨基酸序列文件(12X V2版)，并候選E≤10-5的序列作為候選蛋白序列，刪除重復序列、不完整序列和不能編碼氨基酸的序列。對獲得的葡萄STS成員根據其染色體定位順序進行命名。利用MEME(http://meme.nbcr.net/meme)工具鑒定葡萄STS蛋白的保守基序，參數設置為基序數量8個。利用MEGA 6.0軟件構建系統進化樹，進化樹生成算法為(Neighbor-Joining，NJ)，校驗參數Bootstrap重復1 000。

1.3 葡萄RNA的提取和STS基因的半定量表達

總RNA的提取參照RNeasy plant mini kit試劑盒(Qiagen)使用說明書進行，提取后使用DNase Ⅰ降解RNA中存留的DNA。用Nanodrop ND-2000 spectrophotometer(Thermo)進行定量，取1 mg總RNA，用RevertAid M-MuLV反轉錄酶(Fermentas)0.5 mg oligo(dT)18進行反轉錄。使用Taq DNA Polymerase(Promega)對反轉錄產物進行PCR擴增(引物見表3)。RT-PCR反應程序為95 ℃ 20 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，25個循環。擴增結束后在1.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳，使用凝膠成像系統拍照。

2 結果與分析

2.1 STS基因家族全基因組鑒定和序列分析

以PFAM數據庫中的STS氨基酸保守序列文件(PF00195和PF02797)為種子序列，利用HMMER軟件搜索葡萄基因組中的氨基酸序列數據，結果共發現了48個葡萄STS候選基因，根據它們在染色體上的相對位置依次命名為VvSTS1—VvSTS48，其中VvSTS1—VvSTS6位于10號染色體，而VvSTS7—VvSTS48位于16號染色體。對以上48個序列逐個進行人工序列分析，結合以前對葡萄STS基因序列的研究，發現VvSTS2、VvSTS8、VvSTS11、VvSTS12、VvSTS13、VvSTS14、VvSTS25、VvSTS26、VvSTS33和VvSTS34的開放閱讀框不完整，有序列缺失現象；而VvSTS1、VvSTS3、VvSTS4、VvSTS18、VvSTS40和VvSTS44雖然序列長度符合，但不能翻譯為正確的氨基酸序列。

除去以上序列，本文對剩余的32個STS基因序列進行了下一步的序列分析(表1)。分析結果表明，葡萄STS基因非常保守，均由2個外顯子和1個內含子組成。所有基因的第1個外顯子長度為178 bp，第2個外顯子的長度為1 001 bp，但內含子長度變化較大，長度為138～389 bp。所有的STS基因開放閱讀框長度一致，因此，葡萄STS基因均編碼392個氨基酸。DNAMAN分析結果表明，葡萄STS基因家族成員氨基酸序列之間的一致性非常高，平均一致性為96.64%，最高一致性為99.7%(VvSTS35和VvSTS45、VvSTS35和VvSTS41、VvSTS45和VvSTS41)，最低一致性為90.6%(VvSTS32和VvSTS38)。利用MEGA 5分析葡萄STS基因家族系統進化情況，根據進化關系將它們分為3組(圖1)：A組包括VvSTS5和VvSTS6，位于10號染色體；B組和C組含有的成員較多，均位于16號染色體。利用MEME在線工具分析不同STS基因家族成員的蛋白序列保守基序，共得到8個保守基序(圖1)，分別命名為Motif 1—Motif 8，這些基序為所有STS基因共有(表2)。

表1葡萄STS基因家族鑒定

Table1Identification ofSTSgene family in grape

基因名稱Gene names外顯子1染色體位置Location of exon 1 in chromosome外顯子2染色體位置Location of exon 2 in chromosome內含子長度Length of intron/bp基因在染色體上的方向Direction of genein chromosomeVvSTS5chr10: 14298957..14299134chr10: 14299520..14300520387正向PlusVvSTS6chr10: 14304787..14304964chr10: 14305350..14306350387正向PlusVvSTS7chr16: 16239028..16239205chr16: 16239564..16240564360正向PlusVvSTS9chr16: 16268816..16268993chr16: 16269352..16270352360正向PlusVvSTS10chr16: 16276570..16276747chr16: 16277105..16278105359正向PlusVvSTS15chr16: 16335697..16335874chr16: 16336233..16337233360正向PlusVvSTS16chr16: 16344516..16344339chr16: 16344202..16343202138反向MinusVvSTS17chr16: 16347949..16347772chr16: 16347580..16346580193反向MinusVvSTS19chr16: 16368410..16368233chr16: 16367907..16366907327反向MinusVvSTS20chr16: 16387529..16387352chr16: 16387013..16386013340反向MinusVvSTS21chr16: 16398234..16398411chr16: 16398770..16399770360正向PlusVvSTS22chr16: 16406519..16406342chr16: 16406205..16405205138反向MinusVvSTS23chr16: 16409837..16409660chr16: 16409469..16408469192反向MinusVvSTS24chr16: 16413317..16413140chr16: 16412948..16411948193反向MinusVvSTS27chr16: 16468549..16468372chr16: 16468015..16467015358反向MinusVvSTS28chr16: 16478613..16478436chr16: 16478097..16477097340反向MinusVvSTS29chr16: 16493131..16492954chr16: 16492597..16491597358反向MinusVvSTS30chr16: 16505168..16504991chr16: 16504636..16503636356反向MinusVvSTS31chr16: 16509479..16509302chr16: 16508942..16507942361反向MinusVvSTS32chr16: 16511216..16511393chr16: 16511602..16512602210正向PlusVvSTS35chr16: 16527862..16527685chr16: 16527326..16526326360反向MinusVvSTS36chr16: 16557435..16557258chr16: 16556945..16555945314反向MinusVvSTS37chr16: 16588984..16588807chr16: 16588447..16587447361反向MinusVvSTS38chr16: 16608730..16608553chr16: 16608176..16607176378反向MinusVvSTS39chr16: 16617258..16617081chr16: 16616702..16615702380反向MinusVvSTS41chr16: 16624624..16624447chr16: 16624086..16623086362反向MinusVvSTS42chr16: 16629091..16628914chr16: 16628536..16627536379反向MinusVvSTS43chr16: 16645747..16645570chr16: 16645190..16644190381反向MinusVvSTS45chr16: 16675524..16675347chr16: 16674986..16673986362反向MinusVvSTS46chr16: 16684264..16684087chr16: 16683709..16682709379反向MinusVvSTS47chr16: 16699842..16699665chr16: 16699303..16698303363反向MinusVvSTS48chr16: 16711818..16711641chr16: 16711281..16710281361反向Minus

2.2 STS基因家族的表達

為了分析葡萄STS基因家族成員在果實生長過程中的表達，本研究結合遺傳進化樹的聚類結果，選擇VvSTS5、VvSTS10、VvSTS16、VvSTS17、VvSTS19、VvSTS27、VvSTS35、VvSTS36和VvSTS42作為代表，通過半定量RT-PCR進行了基因表達研究，所用引物見表3。

半定量RT-PCR的結果(圖2)表明：在果實生長過程中，A組的VvSTS5在花后20～30 d表達量逐漸降低，花后40 d基本恢復到花后20 d的水平，但隨后表達量再次下降；花后70～80 d表達水平達到最高，花后90 d略有下降。B組中，VvSTS10和VvSTS42的表達水平在花后20～80 d基本不變，只是在花后90 d略有下降；VvSTS35和VvSTS27的表達水平均在花后20、40和80 d較高，其余時期表達水平較低，但VvSTS35的表達水平總體上低于VvSTS27；VvSTS36的表達水平在花后20 d較高，隨后逐漸下降，直到花后50 d開始升高直至花后80 d達到最高水平。C組的VvSTS19和VvSTS17在整個果實生長過程中表達水平一直較高，特別是花后20、40和80 d；VvSTS16的表達變化趨勢與B組的VvSTS36基本一致。總體來說，大多數葡萄STS基因在花后20～40 d和花后70～80 d的表達水平較高。

圖1 葡萄STS基因家族系統進化和蛋白保守基序Fig.1 Phylogenetic tree and amino acid motifs of STS proteins in grape

表2葡萄STS基因家族氨基酸序列保守基序

Table2Motifs sequence ofSTSgenes in grape

序號Motif No.序列Consensus sequenceMotif 1LVYQSDYADGTFRVT Motif 2LKAJKEYGRAKSKATHLVIDT Motif 3GNLREVGLTFHLWPNVPTLISENIEK-CLTQAFDPLGISDWNSLFWIAHPG Motif 4MRKKSLKGEKATTGEGLDWGVLFGFG-PGLTIETVVLHSVPM Motif 5HPGIGAYLANSLNJEQEVIRA Motif 6KDLAENNAGAR Motif 7EVPKLGKEMotif 8SEGAJD

A，丙氨酸；C，半胱氨酸；D，天冬氨酸；E，谷氨酸；F，苯基丙氨酸；G，甘氨酸；H，組氨酸；I，異亮氨酸；K，賴氨酸；L，亮氨酸；M，蛋氨酸；N，天冬酰胺；P，脯氨酸；Q，谷氨酰胺；R，精氨酸；S，絲氨酸；T，蘇氨酸；V，纈氨酸；W，色氨酸；Y，絡氨酸。

A， Alanine; C， Cysteine; D， Aspartic acid; E， Glutamic acid; F， Phenylalanine; G， Glycine; H， Histidine; I， Isoleucine; K， Lysine; L， Leucine; M， Methionine; N， Asparagine; P， Proline; Q， Glutamine; R， Arginine; S， Serine; T， Threonine; V， Valine; W， Tryptophan; Y， Tyrosine.

2.3 不同時期葉片中STS基因家族的表達

STS基因家族在不同時期葉片中的表達模式可以分為3種類型(圖3)：(1)VvSTS10、VvSTS19、VvSTS27和VvSTS35在不同時期葉片中表達水平基本不變；(2)VvSTS5和VvSTS16的表達趨勢一致，即在成熟葉和衰老葉中的表達水平要顯著高于幼葉；(3)VvSTS17、VvSTS36和VvSTS42在成熟葉中的表達水平要顯著高于幼葉和衰老葉。總體來看，葡萄STS基因在成熟葉和衰老葉中的表達水平要高于幼葉。

3 討論

迄今為止，人們已經從花生、高粱、松樹和葡萄等一些植物中獲得了多個STS基因。在花生[7]和松樹[8-9]中，STS是由2～5個成員構成的基因家族，而高粱的基因組中卻只發現了1個STS基因[15]。但是，自葡萄基因組測序完成后，多個研究結果表明，STS基因在葡萄中數量較多，達到40余個，而且大部分具有完整開放閱讀框[11-13]。在本研究中，我們也從葡萄基因組中鑒定出48個可能的STS基因，經過序列分析，最終確定了32個能編碼完整STS蛋白的序列用于后續研究。

表3半定量RT-PCR引物

Table3Primers used for semi-quantitative RT-PCR

基因名稱Gene names引物序列Sequences of primers (5′ → 3′)基因名稱Gene name引物序列Sequences of primers (5′ → 3′)VvSTS5F: TAGTGGGTCAAGCCCTTTTR: TTGTCCCCTTCTGATTTTTVvSTS27F: CTTTTGACCCACTTGGTATR: CAATGTTTAGGGAATCTTCVvSTS10F: TTCTTGTGGTGTGCTCTGAR: AGTACTATTATTAACTTTGVvSTS35F: CTAGACTTGGTAGGGATGCR: GATACATTACGCCATTGAAVvSTS16F: AAACTGCTTTGGACTCTTTR: TGCGATAACTTCGTTATTGVvSTS36F: GCTAATCTCTTGGGGCTTGR: AACTGTAGGAATGCTACGCVvSTS17R: TGCGATAACTTCGTTATTGVvSTS42F: GACCACTTTTCCAGCTCGTR: TTTGCTAACTCCTATTTGAVvSTS19F: GCTATTGCAGGCAACTTACR: GTCCTCCAACAATCGTAAAVvActinF: TGGTATTGTGCTGGATTCTGGTGR: AGATGGCTGGAAGAGGACTTCTG

20、30、40、50、60、70、80、90代表花后天數(d)。20， 30， 40， 50， 60， 70， 80 and 90 meant days after full bloom (DAFB).圖2 葡萄STS基因在果實生長過程中的表達Fig.2 Expression patterns of STS genes during development of grape berries

Y，幼葉；M，成熟葉；S，衰老葉。Y， Young leaves; M， Mature leaves; S， Senescent leaves.圖3 葡萄STS基因在不同時期葉片中的表達Fig.3 Expression patterns of STS genes in different status leaves of grape

STS基因家族成員在葡萄中數量眾多，這種現象其實在葡萄中比較常見，特別是一些次生代謝相關基因家族。比如，在葡萄中發現了13個苯丙氨酸解氨酶基因，但在擬南芥、水稻和楊樹中的數量卻只有4～8個[16]。葡萄中萜烯合成酶和類黃酮-3’，5’-羥化酶基因家族成員的數量也分別達到35和13個[16-17]。以前的研究[11-13]和本研究均發現，絕大部分STS基因位于16號染色體上一個450～500 kb的區段，在這個區段中存在著大量旁系同源區域，而這些旁系同源區域正是由于基因復制而形成的[12]。葡萄基因組的研究結果也表明，17.5%的葡萄染色體是通過復制形成的，而且還發現16號染色體中的片段復制比例在所有染色體中最高，達到了25.08%[18]。因此，我們認為葡萄次生代謝相關的許多基因家族成員眾多的這種現象主要和葡萄基因組的多次復制有關，多次復制導致基因丟失和基因重組現象的發生，也進而影響基因的拷貝數，這也是基因組和遺傳體系進化的主要動力之一[19-20]。

在赤霞珠[21]和蛇龍珠[22]葡萄果實生長過程中，白藜蘆醇含量在花后40 d以前、轉色至始熟期含量較高，呈雙峰曲線。Shi等[13]在毛葡萄和歐洲葡萄的研究中也發現同樣的趨勢。Gatto等[23]的研究也發現，從轉色期到始熟期是白藜蘆醇快速積累期。STS是合成白藜蘆醇的關鍵酶，本研究的結果表明，大多數的STS基因在花后20～40 d和花后70～80 d表達水平較高，尤其是VvSTS5、VvSTS19、VvSTS26、VvSTS27和VvSTS35等，這樣的結果也表明以上幾個STS基因與果實生長過程白藜蘆醇的生物合成密切相關。另外，在栽培實踐中，葡萄成熟期一般都會進行控水，這會在一定程度上使葡萄受到干旱脅迫，而STS是一種脅迫誘導型表達基因，因而果實成熟期STS表達水平較高。

在本研究中，我們發現大多數的葡萄STS基因在成熟葉或衰老葉中的表達水平要高于幼葉，或者至少與幼葉的表達水平相當。Alessandro等[12]也發現很多葡萄STS基因在衰老葉中的表達水平要高于幼葉。葉片向成熟和衰老發展的過程受到精密調控，在這個過程中葉片細胞會對一些衰老基因、內源信號和外界環境產生響應[24]。這些外界環境往往會是一些非生物逆境(干旱、高溫)和生物逆境(病原菌)，在這些逆境的作用下，具有脅迫響應特性的STS基因表達水平也會升高。另一方面，成熟和衰老過程中會產生更多的脫落酸、乙烯、水楊酸和茉莉酸等內源激素，一些試驗證明這些內源激素可以提高STS基因的表達和芪類化合物的合成[25-26]。Xu等[27-28]還發現，葡萄STS基因啟動子序列中存在很多響應脫落酸、乙烯、水楊酸和茉莉酸的順式作用元件。因此，我們認為在成熟和衰老過程中產生的越來越多的上述內源激素，會不斷增強STS基因啟動子的活性，從而促進STS基因的表達。