基于SRAP分子標記技術研究浙產梔子遺傳多樣性

姜 武，吳時武，吳志剛，陶正明，*

(1.浙江省亞熱帶作物研究所，浙江 溫州 325005； 2.泰順縣林業局，浙江 泰順 325500)

梔子(GardeniajasminoidesEllis)為茜草科梔子屬多年生常綠灌木，是我國傳統的大宗藥材，以干燥成熟果實入藥，具有瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒等功效[1]。梔子是衛計委公布的101種藥食同源名錄中的物種之一，從其果實中提取的梔子黃色素和梔子藍色素是較好的天然著色劑，是當前國際上流行的天然食品添加劑，僅日本每年消耗的梔子黃色素就達320 t，且需求量逐年增大[2]。

我國大面積栽培梔子歷史悠久，最早從漢代開始便有人工栽培梔子的記載，當前梔子主產區以江西、湖南、貴州、福建、浙江等省為主[3]。近幾十年來，科研人員不斷進行梔子品種選育研究，湖南省在20世紀80年代就篩選出了湘梔子3號、18號、20號等優良類型[4]；曹嵐等[5]從果色、果形、果熟期等方面將江西產黃梔子分成25個不同類型，比對江西梔子主要成分含量，選出新干4、5、9號優良品系；周昌華等[6]按生物學性狀指標將四川產區的黃梔子分為6個類型，提出不同類型梔子應區分適用醫用藥材和工業色素提取。品種選育的不斷進行以及野生資源的減少，梔子遺傳多樣性受到較大影響，不利于梔子的資源利用和保護。近年來，科研人員應用ISSR和RAPD技術研究報道了江西省[7]、四川省[8]等產區梔子遺傳多樣性，但未見有針對浙江產梔子相關分子標記研究的報道。本研究采用SRAP技術，對浙江居群、華中居群、西南居群21個梔子樣品的遺傳多樣性進行研究，旨在為梔子的道地性研究提供依據，以更好開發及選育浙產梔子種質資源。

1 材料與方法

1.1 材料

梔子采集于浙江居群(浙江省、福鼎市)、華中居群(江西省、湖南省)、西南居群(四川省、湖北省、貴州省)生長良好的梔子GardeniajasminoidesEllis葉片，共21個樣品，各樣品位置信息如表1所示。樣品經浙江省亞熱帶作物研究所陶正明副研究員鑒定后，置于變色硅膠密封袋中干燥保存。

1.2 基因組DNA提取

將100～500 mg葉片組織在加液氮條件下在研缽中搗成粉末，采用VWI的plant DNAzol試劑進行基因組DNA提取，每個梔子樣品逐一提取DNA，核酸蛋白分析儀測定其質量濃度和質量分數，統一稀釋至20 ng·μL-1，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性后于-20 ℃保存待用。

1.3 SRAP-PCR擴增程序

本實驗選取最佳退火溫度為52 ℃。其PCR反應體系為25 μL體系：12.5 μL高效率的2×預混型Taq酶，1 μL濃度為10 mmol·L-1的引物，模板DNA含量40～60 ng，補水至25 μL。SRAP-PCR的擴增程序為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，共35個循環；最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。反應產物采用6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，5×TBE緩沖液，100 V電泳1.5 h。電泳結束后紫外凝膠成像系統下觀察拍攝，并保存。

1.4 SRAP數據分析

根據SRAP-PCR電泳結果，選取清晰可辨的電泳條帶，在同一位點有清晰譜帶的記為“1”，無條帶時賦值為“0”，組成0/1矩陣圖。采用PopGene version 1.32軟件對條帶統計數據進行分析，計算多態位點百分率(PPB)、等位基因數(number of alleles，Na)、有效等位基因數(Ne)、Nei’s基因多樣性指數(H)、Shannon’s多態性信息指數(I)、Nei’s基因分化系數(Gst)、居群總基因多樣性(Ht)、居群內基因多樣性(Hs)、基因流(Nm)；采用Ntsys-PC 2.1軟件進行UPGMA分析。

2 結果與分析

2.1 SRAP-PCR結果

表1梔子樣品信息

Table1Information ofGardeniajasminoidessamples

編號No.采樣點Sampling sites經度Longitudes (E)緯度Latitudes (N)海拔Altitude/m居群Populations1浙江省永嘉縣橋下鎮Qiaoxia town Yongjia country Zhejiang province120°32′66.20″28°10′66.18″103浙江Zhejiang2浙江省永嘉縣金溪鎮Jinxi town Yongjia country Zhejiang province120°32′43.68″28°16′22.66″405浙江Zhejiang3浙江省淳安縣臨岐鎮 Linqi town Chunan country Zhejiang province119°14′02.77″29°56′87.44″442浙江Zhejiang4浙江省平陽縣昆陽鎮 Kunyang town Pingyang country Zhejiang province120°29′65.42″27°41′19.11″410浙江Zhejiang5浙江省蒼南縣五鳳鄉 Wufeng town Cangnan country Zhejiang province120°17′55.14″27°24′11.78″301浙江Zhejiang6浙江省溫州市龍灣區海城街道120°45′14.97″27°50′34.36″71浙江ZhejiangHaicheng street Longwan district Wenzhou city Zhejiang province7浙江省溫州市龍灣區瑤溪街道120°46′51.32′27°55′33.56″188浙江ZhejiangYaoxi street Longwan district Wenzhou city Zhejiang province8浙江省泰順縣彭溪鎮(百年生)120°13′73.61″27°26′22.56″435浙江ZhejiangPengxi town Taishun country Zhejiang province (A hundred years)9浙江省泰順縣彭溪鎮(二年生)120°14′11.21″27°25′84.91″434浙江ZhejiangPengxi town Taishun country (Two years)10浙江省泰順縣百丈鎮(十年生)119°52′78.76″27°37′65.11″481浙江ZhejiangBaizhang town Taishun country Zhejiang province (Ten years)11浙江省泰順縣彭溪鎮(二十年生)120°13′16.41″27°27′78.82″298浙江ZhejiangPengxi town Taishun country Zhejiang province (Twenty years)12浙江省文成縣周壤鎮 Zhourang town Wencheng country Zhejiang province120°10′11.21″27°50′78.17″498浙江Zhejiang13江西省婺源縣清華鎮 Qinghua town Wuyuan country Jiangxi province117°46′11.47″29°25′33.81″121華中Central China14江西省新干縣界埠鎮 Jiebu town Xingan country Jiangxi province115°18′12.87″27°44′11.61″130華中Central China15江西省金溪縣雙塘鎮 Shuangtang town Jinxi country Jiangxi province116°42′69.54″28°05′37.87″143華中Central China16四川省資中縣新橋鎮 Xinqiao town Zizhong country Sichuan province104°43′11.67″29°45′53.76″419西南Southwest China17湖南省瀏陽市柏加鎮 Baijia town Liuyang city Hunan province113°15′16.54″28°02′87.54″68華中Central China18湖北省武漢市木蘭鄉 Mulan town Wuyuan city Hubei province114°26′13.49″31°06′27.69″101西南Southwest China19福建省福鼎市分水關 Fenshuiguan town Fuding city Fujian province120°15′61.78″27°25′69.11″286浙江Zhejiang20貴州省德江縣青龍鎮 Qinglong town Dejiang country Guizhou province108°10′19.58″28°15′31.54″732西南Southwest China21貴州省丹寨縣興仁鎮 Xingren town Danzhai country Guizhou province107°48′81.11″26°19′41.19″833西南Southwest China

19號分水關采樣點與浙南接壤，劃歸到浙江居群。

No.19 (Fenshuiguan) was classified to Zhejiang population for the sampling point borders was upon southern Zhejiang.

從88對SRAP引物中篩選出擴增條帶清晰、多態性明顯的6對SRAP引物，引物序列見表2。梔子SRAP-PCR擴增的結果表明，21個樣品共檢測到98條擴增條帶，其中多態性條帶87個，PPB為88.78%，不同引物組合檢測到的位點數差距較大，其中ME-2/em-2組合多態性位點最少，為8個，但多態率最高，為100%(表3、圖1)。

2.2 遺傳多樣性分析

利用PopGene 1.32軟件對梔子進行遺傳多樣性分析，結果表明，梔子總體物種水平的Na為1.877 6，Ne為1.515 2，H為0.308 9，I為0.465 1，PPB為88.78%。各居群的Na變化幅度為1.530 6～1.775 5，平均1.636 0；Ne變化幅度為1.382 0～1.434 6，平均1.414 4；H變化幅度為0.212 0～0.258 1，平均0.236 7；I變化幅度為0.309 4～0.390 4，平均0.350 2；PPB變化幅度為53.06%～77.55%，平均63.60%(表4)。梔子3個居群之間的遺傳多樣性Ht為0.309 2，種間遺傳多樣性Hs為0.236 7，基因分化系數Gst為0.235 6，即居群間遺傳變異占居群遺傳變異的23.56%，76.44%的遺傳變異在種內進行；種群間的遺傳分化系數基因流Nm為1.621 8，證明居群間存在一定的基因流動。

表2SRAP引物序列

Table2Primer sequences for SRAP

引物名稱Primer nameME引物序列(5′-3′)ME primer sequence (5′-3′)em引物序列(5′-3′)em primer sequence (5′-3′)ME-2/em-2TGAGTCCAAACCGGAGCGACTGCGTACGAATTTGCME-2/em-6TGAGTCCAAACCGGAGCGACTGCGTACGAATTGCAME-2/em-7TGAGTCCAAACCGGAGCGACTGCGTACGAATTATGME-4/em-1TGAGTCCAAACCGGACCGACTGCGTACGAATTAATME-4/em-4TGAGTCCAAACCGGACCGACTGCGTACGAATTTGAME-4/em-11TGAGTCCAAACCGGACCGACTGCGTACGAATTTCG

表3SRAP引物組合的擴增結果

Table3Amplification results of combinated SRAP primers

引物名稱Primer name擴增條帶數Total number of bands多態性條帶數Number of polymorphic bandsPPB/%條帶大小Stripe size/bpME-2/em-288100100～2000ME-2/em-6161593.750～2000ME-2/em-7151386.67100～2000ME-4/em-1201785.000～2000ME-4/em-4201785.000～2000ME-4/em-11191789.470～2000平均 Average16.3314.5088.78總計 Total9887

圖1 SRAP引物ME-2/em-2對21份梔子總DNA的擴增結果Fig.1 Amplification results of total DNA based on SRAP primer ME-2/em-2 from 21 types of G. jasminoides

2.3 聚類分析

根據SRAP擴增結果，利用NTSYS軟件處理數據，對梔子材料進行聚類分析(圖2)。21個樣品梔子的相似系數介于0.61～0.89。在遺傳相似系數為0.61時，可分為2大類群。在相似系數為0.672時，可分為4大類型，其中浙江居群的大部分種質(樣品編號1永嘉橋下、2永嘉金溪、3淳安臨岐、5蒼南五鳳、6龍灣海城、7龍灣瑤溪、8泰順彭溪百年生、9泰順彭溪二年生、11泰順彭溪二十年生)聚為Ⅰ類，華中居群(樣品編號13婺源清華、14新干界埠、15金溪雙塘、17瀏陽柏加)聚為Ⅱ類，西南居群(樣品編號16資中新橋、18武漢木蘭、20德江青龍)聚為Ⅲ類，這3類均為相同地域來源的梔子聚在同一組，說明同一居群內的梔子樣品遺傳相似性高，親緣關系近，不同地理來源的梔子遺傳多樣性有差異；而浙江居群中的小部分種質(樣品編號4、10、12、19)和西南居群(樣品編號21)聚成第Ⅳ類，說明浙江居群中的平陽種質、泰順百丈種質、分水關種質、文成周壤和西南居群的丹寨興仁種質親緣性較近。

表4梔子居群遺傳多樣性

Table4Genetic diversity ofG.jasminoides

居群PopulationsNaNeHIPPB/%浙江Zhejiang1.7755±0.41941.4346±0.35850.2581±0.18440.3904±0.256377.55華中Central China1.5306±0.50161.3820±0.41950.2120±0.21670.3094±0.306653.06西南Southwest China1.6020±0.49201.4265±0.40670.2399±0.21210.3507±0.300760.20居群水平Population level1.63601.41440.23670.350263.60物種水平Species level1.8776±0.32951.5152±0.31420.3089±0.15510.4651±0.212188.78

浙江種源數13個；華中種源數4個；西南種源數4個。

Number of Zhejiang population was 13; Number of Central China population was 4; Number of Southwest China population was 4.

圖2 基于SRAP的梔子居群UPGMA分析聚類圖Fig.2 UPGMA dendrogram of G. jasminoides based on SRAP

3 討論

近些年來基于分子標記研究表明，即使是瀕危物種，也可以保持較高的遺傳多樣性[9]。如珍稀瀕危植物太行菊(Opisthopappustaihangensis)，PPB為81.11%[10]，梔子的PPB為88.78%，H為0.308 9，I為0.465 1，遠高于81.11%，表明梔子具有較高的遺傳多樣性，在物種水平上的遺傳變異較高。在居群水平上，梔子的PPB在53.06%～77.55%，從高到低依次為浙江居群>西南居群>華中居群，說明浙江居群遺傳多樣性變異水平最高，適應環境能力相對較強。H和I值顯示各居群的遺傳變異大小順序與PPB結果完全一致。UPGMA聚類結果表明，21份梔子種質資源可分為4組，Ⅰ類，Ⅱ類和Ⅳ類均按照地理居群位置趨勢聚成一組，相同地域采集的物種遺傳相似性高，在系統發育樹上聚在一起。而Ⅳ類中浙江居群的平陽種質、泰順百丈種質、分水關種質、文成周壤和西南居群的丹寨興仁種質聚在一起，表明這幾個產區的梔子種源存在相互引種交流。另外，聚類分析結果顯示，3個泰順彭溪種質，即二年生、二十年生、百年生，均聚類在一起，且遺傳距離非常近，說明近百年來彭溪地區栽培的梔子種質比較穩定，具有一定道地性。南宋謝靈運《游名山志》載：“樓石山多梔子”，據調查樓石山就在如今的蒼南、平陽、泰順一帶，說明溫州人工栽培梔子歷史悠久，且《雁蕩山志》(明·萬歷)和《樂清縣志》(清·道光)均有溫州產梔子作為染料和藥用的記載，說明溫州地區對梔子的生產和使用距今至少已有400多年。

遺傳分化是指遺傳多樣性在居群內和居群間的分布。本研究中梔子21個種源在總的遺傳變異中有接近76.44%的變異發生在居群間(Gst=0.235 6)，23.56%的遺傳分化存在于居群內。為更好地管理和保護梔子資源，應在梔子不同產區之間盡可能多地選育栽培梔子種質。基因流是基因在種群內和種群間的運動，基因流的強弱對種群分化具有重要影響，當Nm>1時，基因流可防止遺傳漂流引起的種群之間的遺傳分化，本研究梔子種質Nm=1.621 8，表明遺傳漂流等因素引起的梔子物種遺傳多樣性下降被基因流有效抵制了。

浙江省是全國梔子的重要產區，2018年全省梔子種植面積約4 933 hm2，平均年產1.35萬t。浙產梔子主要在浙南地區(溫州)，種植面積約3 000 hm2，年產量占全省90%左右。溫州當地視梔子為道地藥材，有“溫梔子”的習稱。由于在2010—2013年期間種植的梔子已經逐步進入盛果期，梔子投產面積逐步加大，過高的產量和庫存量對梔子市場形成巨大壓力，2017年梔子鮮果收購價格跌至0.8～1.0元。近年來收購的藥商明顯減少，如果沒有新的消耗渠道形成，2013年前火爆的梔子市場局面將較難出現。當前浙產梔子并無省農業廳審定的栽培新品種，優良品種的選育工作迫在眉睫，本研究運用SRAP分子標記技術，首次報道了浙產梔子的遺傳多樣性，可為該物種的保護和浙產梔子的品種選育提供參考。