藍莓枝干潰瘍病病原鑒定及品種抗病性研究

康海婷，凌丹燕，2，吳志娟，路 梅，宗 宇，郭衛東，*

(1.浙江師范大學 化學與生命科學學院，浙江 金華 321004； 2.金華市荊龍生物科技有限公司，浙江 金華 321000)

藍莓(blueberry)是杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vaccinium)多年生灌木果樹，其果實富含維生素、礦物質、抗氧化物質和花青素，具有較高的營養價值和醫療保健作用[1]。我國從1983年開始進行藍莓的引種栽培，經過30多年的發展，現已初步形成了東北地區、山東半島、長江中下游和云貴高原4個主產區[2]。浙江省、江蘇省和江西省等長江中下游地區均有較大規模的藍莓種植，其中以浙江省栽培面積最大。隨著栽培規模的不斷擴大，影響藍莓樹體生長、果實質量和產量的真菌性病害逐漸凸顯出來，給藍莓產業帶來了重大損失[3-5]。

枝干潰瘍病是浙江省近年新發生最為嚴重的藍莓病害之一，該病會導致藍莓枝干大量枯死，果實產量大幅度降低。國內外研究發現，導致藍莓枝干潰瘍病的病原較多，主要為葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)。葡萄座腔菌主要通過傷口侵染植株，尤其是每年5—6月雨水充沛的季節，受到機械損傷的藍莓植株在自然界被侵染的機率大大增加[4-5]。藍莓枝干潰瘍病與其他病原菌引起的枝條枯萎病等病害的癥狀非常相似，僅發病起始位置有差異，病原菌初始侵染時間短，田間不易察覺，這為枝干潰瘍病的防治帶來了較大困難[6]。因此，進行病原菌的快速分離鑒定、篩選抗病性強的品種成為藍莓枝干潰瘍病的關鍵防治策略。

本研究采集藍莓不同品種的染病葉片和枝條，采用傳統形態學和分子生物學結合的方法對分離菌株進行鑒定，以期明確浙江省金華市疑似枝干潰瘍病的藍莓病株的病原菌，為該病的田間診斷及綜合防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 藍莓樣品采集、病原菌分離和形態學觀察

2015年3月至2016年3月在浙江師范大學藍莓基地采集藍莓染病枝條，記錄其發病癥狀并拍照。

參考方中達常規組織分離法并進行改良[7]，對具備典型癥狀的病樣用水沖洗，從病健交界處剪取病樣材料，放入75%乙醇中表面消毒30 s，無菌水漂洗3次后置于1% NaClO溶液中消毒10 min，之后用無菌水漂洗3次，用滅菌濾紙吸干表面水分。在無菌條件下將材料剪成0.5 cm×0.5 cm的組織塊，將其置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)培養基中25 ℃進行培養。培養3 d后挑取菌落邊緣菌絲轉接到PDA培養基上進行純化培養。將分離純化后的病原菌株置于PDA培養基進一步培養，培養條件為25 ℃，16 h光照/8 h黑暗。每天觀察菌落生長狀態和產孢情況。培養7 d后，在顯微鏡下觀察病原菌菌絲及孢子形態，進行病原菌的初步鑒定。

1.2 病原菌DNA提取與rDNA-ITS序列擴增

將分離得到的菌株于PDA固體培養基培養5 d后，采用改良CTAB法提取基因組DNA[8]，使用通用引物ITS1/ITS4進行rDNA-ITS區段擴增。PCR反應體系為25 μL，包括：10×PCR緩沖液2.5 μL，10 mmol·L-1dNTP 2.0 μL，10 μmol·L-1ITS1和ITS4引物各1.0 μL，DNA模板溶液2.0 μL，5 U·μL-1Taq酶0.5 μL，ddH2O 16.0 μL。擴增條件：94 ℃預變性10 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并送上海英濰捷基生物公司測序。

將分離菌株JA4和JB2的rDNA-ITS序列與GenBank中相關序列進行相似度比較，并用MEGA 7.0[9]軟件基于鄰接法(neighbor-joining)構建系統發育樹。

1.3 病原菌致病性檢測

通過柯赫氏法則(Koch’s postulates)對病原菌進行致病性檢測。采集健康且大小均勻的藍莓枝干，用75%乙醇表面消毒，無菌水清洗晾干備用。使用直徑5 mm打孔器在純化培養5 d的病原菌培養基上沿菌落邊緣打孔，然后用無菌3號昆蟲針在藍莓枝干表面針刺“+”(長寬和深度均為5 mm)，菌絲面朝下貼于枝條表面，每個藍莓枝干樣品接種3個病原菌菌餅，同時接種空白PDA培養基作為對照。處理后的藍莓枝干在25 ℃、16 h光照/8 h黑暗條件下保濕培養，每天觀察并記錄發病情況，選取發病明顯的枝條進行病原菌的再分離鑒定。

1.4 不同藍莓品種抗病性測定

以2年生藍莓布里吉塔、奧尼爾、藍豐、藍美人和夏普藍為供試品種，每個品種剪取并篩選健康、生長一致的枝條30根。每個品種選擇5根枝條作為對照，剩余25根枝條接種病原菌。用75%乙醇表面消毒后將枝條置于鋪有保濕濾紙的保鮮盒內培養。接種后噴霧保濕并封閉保鮮盒，置于25 ℃，16 h光照/8 h黑暗保濕培養誘導發病，7 d后記錄不同品種的發病情況。

2 結果與分析

2.1 田間病害癥狀觀察

藍莓枝干潰瘍病主要為害植株枝條，包括主干和側枝。初期在枝干表面出現紫紅色斑點，后逐漸擴展為橢圓形或者圓形大斑。一般情況下病斑從發病部位向四周擴散，病斑表面呈現凹陷開裂。發病嚴重時開裂貫穿整棵植株，影響植株的生長(圖1-a、b)；高濕條件下，病害枝條表面出現菌絲體，呈現白色(圖1-c)；發病枝條橫切面呈現棕黃色(圖1-d)。

a，發病植株；b，發病植株基部；c，發病枝條上分生孢子絲及分生孢子角；d，枝條橫切面。a， Infected plant; b， Base of the infected plant; c， Spore filaments and conidium angles on the infected branches; d， Cross section of branches.圖1 藍莓莖潰瘍病典型癥狀Fig.1 Typical symptoms of blueberry stem canker

2.2 枝干潰瘍病病原菌分離純化

從藍莓病枝分離得到疑似病原菌菌株15株(JA1-JA8、JB1-JB7)。將疑似病原菌分別進行柯赫氏法則驗證，回接材料為藍莓品種布里吉塔。結果表明，接種JA4和JB2菌株5 d后可以看到病斑產生，且后期病斑與藍莓枝干潰瘍病田間自然發病癥狀相同；15 d后藍莓枝條呈現枯萎狀，而對照組中未產生病斑或與自然癥狀不一致。對接種發病后的枝條再次進行病菌的分離培養，生長狀態與接種病原菌一致；因此菌株JA4和JB2為藍莓枝干潰瘍病致病菌。

a，JA4菌株侵染處理組；b，JA4對照組；c，JB2菌株侵染處理組；d，JB2對照組。a， Infection treatment group of strain JA4; b， Control group of JA4; c: Infection treatment group of strain JB2; d， Control group of JB2.圖2 藍莓枝干潰瘍病病原菌JA4和JB2致病性檢測Fig.2 Pathogenicity test of strain JA4 and JB2 on blueberry branch

2.3 病原菌傳統形態學鑒定

2.3.1 病原菌JA4形態學特征

將分離得到的JA4菌株在PDA培養基進行培養，菌絲初期呈現白色，5 d后菌落直徑達到9 cm；隨著培養時間增長，菌絲顏色逐漸加深，變成灰白色(圖3-a)；菌絲相互纏繞，形成黑色球形顆粒狀的分生孢子器(圖3-b)；分生孢子器于15 d開始產生分生孢子。光學顯微鏡鏡檢發現，JA4病原菌菌絲具隔膜，直徑2.0～10.0 μm(圖3-c、d)；分生孢子梗在基部和頂部有分枝，無色，通常具多個隔膜(圖3-e)。分生孢子為鉤狀β型分生孢子，單孢，無色，無油球，大小為15～20 μm×1～3 μm(圖3-f)。

a，菌落；b，分生孢子器；c，菌絲(400×)；d，菌絲膨大(400×)；e，分生孢子器(400×)；f，分生孢子(400×)。a， The colony morphology on PDA plate; b， Pycnidium; c， Mycelia; d， Expanded mycelium of JA4 (400×); e， Pycnidium (400×); f， Conidium(400×).圖3 擬莖點霉菌JA4在PDA培養基上形態Fig.3 Morphology of Phomopsis sp. JA4 on PDA medium

2.3.2 病原菌JB2形態學特征

將分離得到的JB2菌株在PDA培養基進行培養，菌絲初期呈白色絨狀，與JA4菌株生長速度相似，5 d后菌落直徑達到9 cm。菌絲生長旺盛，氣生菌絲發達，隨著培養時間增長，菌絲顏色也呈現逐漸加深的趨勢，變成灰黑色至黑色，產生分生孢子器(圖4-a、b)；20 d開始產生分生孢子。顯微鏡觀察發現，菌絲具隔膜，灰黑色至黑色(圖4-c、d)；分生孢子器聚生或單生，單腔，分生孢子橢圓形，大小20～30 μm×5～8 μm(圖4-e、f)。

a，菌落；b，分生孢子器；c，菌絲(400×)；d，菌絲膨大(400×)；e，分生孢子器(400×)；f，分生孢子(400×)。a， The colony morphology on PDA plate; b， Pycnidium; c， Mycelia; d， Mycelium enlargement (400×); e， Pycnidium (400×); f: Conidium (400×).圖4 葡萄座腔菌JB2在PDA培養基上形態Fig.4 Morphology of Botryosphaeria dothidea JB2 on PDA medium

2.4 病原菌rDNA-ITS序列分析

分別以菌株JA4、JB2的基因組DNA為模板，用真菌通用引物ITS1和ITS4對核糖體rDNA-ITS進行PCR擴增，得到大小約500 bp的片段。與GenBank已經報道的真菌ITS序列進行聚類分析，結果表明，菌株JA4和JB2分別與擬莖點霉屬真菌(Phomopsissp.)、葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)以較高的自檢支持率聚在一起(圖5)。結合菌絲和分生孢子的形態學特征，初步判斷菌株JA4為腔孢綱(Coelomycetes)球殼孢目(Sphacropsidales)擬莖點霉屬(Phomopsis)真菌；菌株JB2是子囊菌綱(Ascomycetes)假球科目(Pleosporales)葡萄座科(Botryosphaericeae)的葡萄座腔菌。

圖5 基于JA4和JB2菌株及相似屬種rDNA-ITS序列構建的聚類樹Fig.5 Phylogenetic tree of strains JA4， JB2 and relative genera based on rDNA-ITS sequences

不同品種間沒有相同字母表示抗病性差異顯著(P<0.05)。Different letters indicated significant differences on disease resistance among different varieties(P<0.05).圖6 不同藍莓品種對枝干潰瘍病抗病性檢測Fig.6 Resistance detection of different blueberry cultivars to branch stem canker

2.5 不同藍莓品種抗病性分析

將JA4和JB2兩種病原菌活體接種布里吉塔、奧尼爾、藍豐、藍美人和夏普藍等5個藍莓品種上，觀察不同品種的抗病性差異。結果表明，供試藍莓品種的枝條均出現不同程度的發病癥狀，發病率為100%。葡萄座腔菌菌株JB2的致病性強于擬莖點霉屬真菌菌株JA4。供試的5個藍莓品種中，夏普藍和奧尼爾對兩種病原菌的抗性最差，兩個品種對病原菌JA4的抗性差異不顯著，夏普藍對病原菌JB2的抗性顯著弱于其他品種。布里吉塔、藍豐和藍美人3個品種對兩種病原菌的抗性較強，三者抗性之間無顯著差異。

3 討論

藍莓枝干潰瘍病在世界上許多國家發生并有相關報道，美國和加拿大的藍莓種植區是該病發生最嚴重的地區[1，5，10]。葡萄座腔菌屬真菌是引起枝干潰瘍病的主要病原菌，該屬真菌腐生或寄生于植物體內，或以內生真菌形態存在，可引起蘋果(Malus)[11]、桃樹(Prunucepersica)[12]、葡萄、芒果、核桃(Juglansregia)[13]等果樹的枝干潰瘍枯萎、干腐、流膠等不同癥狀，造成果樹嚴重減產。藍莓枝干潰瘍病在我國云南省[4]、遼寧省[1]等藍莓種植區均有發生，引起這兩地枝干潰瘍病的病原菌為葡萄座腔菌(B.dothidea)[4-5]，這與本研究中鑒別出的病原菌相同。

葡萄座腔菌科真菌多為弱寄生菌，條件適宜時容易引起植物病害，對農林生產有著重要的影響，特別是葡萄座腔菌屬(Botryosphaeria)和新殼梭孢屬(Neofusicoccum)等的優勢類群會引起植物莖、枝條或新梢干枯、潰瘍等病癥[12，14-15]。在藍莓上已有病原菌B.dothidea和B.corticis[16-17]、Neofusicoccumarbuti和N.parvum[6，18-19]引起枝干潰瘍病發生的病例報道。葡萄座腔菌科真菌有寄主專化型和廣譜寄生型[20]，這與該科真菌種類繁多，分類地位不明確有關[14，21]。徐成楠等[22]的研究表明，B.dothidea屬于廣譜寄生性真菌，藍莓栽培園周邊的果樹可能是B.dothidea的初侵染源。因此，在藍莓種植園選址時應考慮周邊果樹的栽植及病害發生的動態情況，這為藍莓枝干潰瘍病的早期監測及綜合防控提供參考。

除葡萄座腔科真菌外，座囊菌屬(Dothidea)真菌也可以導致藍莓枝干潰瘍病[23-26]。本研究分離的JA4病原菌被鑒定為擬莖點霉菌(Phomopsissp.)，是座囊菌屬的無性型，多數擬莖點霉菌產生α和β兩類分生孢子。羅麗娟等[27]通過對23個擬莖點霉菌株研究指出，不同的培養基可以誘導擬莖點霉產生不同類型的孢子。在本研究中，JA4菌株的分離純培養使用的均是PDA培養基。因此推測，培養基的單一使用可能是未產生α型分生孢子的原因。后續研究中，開展不同純培養條件下JA4孢子形成的相關實驗。座囊菌屬真菌可以侵害高叢藍莓、兔眼藍莓、黑果越橘、越橘和蔓越橘等越橘屬的多個種，導致枝干潰瘍、枝枯和果腐等病癥[24]。岳清華等[25]指出擬莖點霉菌和葡萄座腔菌導致的藍莓枝干潰瘍的癥狀十分相似，在田間鑒別中很難區分；但擬莖點霉菌在春天條件適宜情況下可由花芽侵入，而葡萄座腔菌必須從傷口侵染[15]。本研究在進行兩種病原菌致病性檢測回接中對枝條都進行了劃傷處理，不能排除兩種病原菌產生復合侵染的可能性，前人在藍莓染病表皮組織切片中觀察到葡萄座腔菌子囊孢子也為復合侵染的存在提供了進一步的證據[15]。

枝干潰瘍病病原菌的多樣性加大了病害防治的難度，篩選抗病藍莓品種是病害綜合防治的有效途徑之一。在本研究供試的5種藍莓品種中，雖不同程度地感染了葡萄座腔菌和擬莖點霉菌，但品種間抗病性存在顯著差異。新建藍莓園應選用抗病性較強的布里吉塔、藍美人或藍豐等品種，減少易感病品種夏普藍和奧尼爾的栽種數量。對于夏普藍和奧尼爾栽植面積較大的建成果園，應定期檢查園內植株發病情況，及時清除病枝，做好田間藥劑防控。

4 結論

擬莖點霉菌(Phomopsissp.)和葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)均可以引起藍莓枝干潰瘍病，擬莖點霉菌在春天條件適宜情況下可由花芽侵入，而葡萄座腔菌必須從傷口侵染；兩種病原菌也可以產生復合侵染。藍莓品種布里吉塔、藍美人和藍豐等品種抗性強；夏普藍易受病原菌侵染，抗病性差。