基于體外降糖活性的桑葚渣水提物的超聲輔助工藝優(yōu)化

范 銘，向 露，劉 哲，陸勝民，*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學院 食品科學研究所，浙江省果蔬保鮮與加工技術研究重點實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部果品采后處理重點實驗室，浙江 杭州 310021； 2.浙江師范大學 化學與生命科學學院，浙江 金華 321004)

桑葚屬于?？疲涣腥胨幨惩疵?，鮮果味道甜美、多汁，含有人體所必需的營養(yǎng)素如維生素、氨基酸、礦物質(zhì)以及具有生理活性的花色苷、黃酮、酚酸類化合物。大量研究表明，桑葚提取物在降血糖、增強免疫、降血脂、抗氧化、抗腫瘤等方面有顯著的作用[1-2]。目前，大多數(shù)關于桑葚的研究主要集中于其化學成分[3]、營養(yǎng)成分[4]、藥理作用[5]以及桑葚產(chǎn)品(桑葚酒[6]、桑葚醋[7]、桑葚汁[8])等方面，但對桑葚中主要起降血糖功效的物質(zhì)提取工藝卻鮮見報道。本文主要采用超聲輔助水提取法優(yōu)化提取桑葚渣中對α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶活性有抑制作用的物質(zhì)成分，據(jù)文獻報道桑葚水提液中槲皮素、花色苷以及多糖等物質(zhì)均有降血糖的作用[3]，這也為工業(yè)大規(guī)模提取桑葚渣中降糖功能因子提供科學依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

桑葚品種大十，采摘于浙江省安吉縣梅溪鎮(zhèn)馬村桑葚基地。榨汁后的桑葚渣以每袋500 g進行分裝，保存于-20 ℃的冰箱中，備用。

1.2 儀器

DHG-9146A電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗室備有限公司)；SCIENTZ-18N冷凍干燥機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；BJ-300多功能粉碎機(拜杰公司)；電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；LXJ-ⅡB型離心機(上海安亭科學儀器廠)；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；UV-1800紫外分光光度計(日本島津公司)。

1.3 試劑

可溶性淀粉、氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、碳酸鈉購于上海國藥集團；對硝基苯基-α-D葡萄糖吡喃苷(PNPG)購于上海源葉生物科技有限公司；二甲基亞砜購于上海凌峰化學試劑有限公司；α-淀粉酶(豬胰腺淀粉酶)、α-葡萄糖苷酶均購于Sigma公司。

1.4 方法

1.4.1 桑葚渣中降糖物質(zhì)提取

稱取在-20 ℃中冷凍的桑葚渣(含水量89%)500 g平鋪于托盤中，鼓風干燥箱中干燥至恒重。干燥條件為50 ℃、48 h。將干燥后的桑葚渣打粉。稱取干燥后的桑葚渣粉5 g，按預設的料液比加入去離子水，充分混勻后，置于預設的提取條件下進行超聲提取，超聲提取結(jié)束后，放入涼水中冷卻，4 000 r·min-1離心10 min留取上清液，即得含有降糖因子的桑葚渣提取原液。將提取原液在50 ℃條件下減壓濃縮至一定體積，將其冷凍干燥(條件：阱溫度-40 ℃左右，真空度0.025 MPa，干燥72 h)后用蒸餾水配成一定的濃度。體外測定其對α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶活性的抑制率，以此作為指標研究提取液的降糖效果。

1.4.2 體外降糖指標及其測定方法

α-葡萄糖苷酶活性抑制體系。通過抑制小腸上端α-葡萄糖苷酶的活性，阻礙直鏈或支鏈低聚糖單元如α-糊精、麥芽糖、麥芽三糖分解產(chǎn)生葡萄糖的過程，從而阻止葡萄糖吸收到血液中，限制胃腸道對食物中碳水化合物的吸收[9]。對α-葡萄糖苷酶的抑制率大小可以作為體外判斷某種物質(zhì)抑制血糖能力的大小。

取10 mmol·L-1PNPG 100 μL，加入850 μL磷酸緩沖液(pH 6.8)，再加入樣品抑制劑， 37 ℃孵化10 min，加入酶50 μL(2 U·mL-1)，再孵化50 min，加入1 mL 1 mol·L-1的Na2CO3終止反應后在405 nm測吸光度(表1)，并計算抑制率[10]?？瞻讓φ諡椴患用傅姆磻w系，以消除PNPG本身氧化產(chǎn)生對硝基苯酚(PNP)而影響測定結(jié)果，以拜糖平為陽性對照[10]。

表1α-葡萄糖苷酶活性抑制體系

Table1Reaction system of α-glucosidase inhibitory activity

處理Treatmentα-葡萄糖苷酶α-glucosidase/μL抑制劑Inhibitor/μLPNPG/μL磷酸緩沖液pH 6.8Phosphate buffer pH 6.8/μL空白管Blank tube(A)50—100850空白對照Blank control(B)——100850抑制劑管Inhibitor tube(C)5025100850背景對照Background control(D)—25100850

α-淀粉酶活性抑制體系。抑制劑能通過抑制腸道內(nèi)唾液和α-胰淀粉酶的活性，阻礙食物中碳水化合物的消化吸收，可有效控制餐后血糖的升高，間接減少體內(nèi)脂肪的合成，延緩糖尿病的發(fā)生和發(fā)展[9]。

取50 μL α-淀粉酶(2 U·mL-1)和一定濃度的抑制劑25 μL，在37 ℃孵化10 min，加入0.75%可溶性淀粉1 mL，37 ℃反應5 min，加入1 mL DNS試劑，沸水浴5 min，迅速水浴冷卻后用蒸餾水稀釋2.5倍，540 nm處測定吸光值，并計算抑制率[10]。反應體系如表2。

1.4.3 單因素試驗

分別以超聲功率200、300、350、400、500 W、超聲溫度30、40、50、60、70 ℃、超聲時間0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h、料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(g·mL-1)為影響因素，設置4個因素的不同水平，以確定相關因素對提取液中降糖因子含量的影響水平。

1.4.4 正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，設計正交試驗，分析正交試驗結(jié)果，確定桑葚渣中降糖因子的最佳提取工藝條件。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有試驗重復3次。試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010、SPSS 17.0進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 料液比對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性抑制率的影響

如圖1所示，桑葚渣水提液對α-淀粉酶的抑制率先升高后降低，料液比為1∶40(g·mL-1)時，對α-淀粉酶的抑制率最高為66.7%，而料液比為1∶30(g·mL-1)時，對α-葡萄糖苷酶的抑制率最高為69.1%，這可能是由于溶劑用量的增加可以增加固液接觸面積，提高擴散速度，但隨著溶劑用量的增加，大量雜質(zhì)溶出，桑葚渣的酶抑制劑提取率降低[11]。所以對于α-淀粉酶而言，料液比選擇1∶30、1∶40、1∶50(g·mL-1)進行正交試驗，而對于α-葡萄糖苷酶而言，料液比選擇1∶20、1∶30、1∶40(g·mL-1)用于進一步優(yōu)化。

表2α-淀粉酶活性抑制體系

Table2Reaction system of α-amylase inhibitory activity

處理Treatmentα-淀粉酶α-amylase/μL抑制劑Inhibitor/μL0.75%可溶性淀粉0.75% soluble starch/mLDNS/mL空白管Blank tube(A)50—11空白對照Blank control(B)——11抑制劑管Inhibitor tube(C)502511背景對照Background control(D)—2511

柱狀圖上無相同小寫字母的表示各組間差異顯著(P<0.05)。下同。The different lowercase letters above the columns represented statistically significant differences among treatments (P<0.05). The same as below.圖1 料液比對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制率的影響Fig.1 Effects of solid-liquid ratio on inhibition rate of α-amylase and α-glucosidase activities

2.1.2 超聲時間對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性抑制率的影響

如圖2，當超聲時間為1.5 h時，提取液對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制率最高，分別為73.2%和75.9%，其趨勢都為先升高后降低。這可能體現(xiàn)了提取量隨時間延長的積累效應，但是過長時間的加熱提取也會使降糖因子遭到破壞[12]。故選擇時間為1.0、1.5、2.0 h用于進一步優(yōu)化。

圖2 超聲時間對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性抑制率的影響Fig.2 Effects of ultrasonic time on inhibition rate of α-amylase and α-glucosidase

2.1.3 超聲溫度對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性抑制率的影響

如圖3，當超聲時間為60 ℃時，抑制劑對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制率最高，分別為64.2%和66.7%。這可能是由于隨著超聲溫度升高，分子動能增加、運動速度加快，滲透、擴散加快，使降糖物質(zhì)更易轉(zhuǎn)移到溶劑中的緣故。然而，當溫度繼續(xù)升高，對酶的抑制效果下降，這可能與降糖物質(zhì)在高溫條件下被氧化破壞有關[13]。故選擇溫度為50、60、70 ℃用于進一步優(yōu)化。

2.1.4 超聲功率對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性抑制率的影響

如圖4，不同超聲功率提取的桑葚渣水提液對α-淀粉酶的抑制率先升高后降低，超聲功率為300 W時，對α-淀粉酶的抑制率最高為49.4%，而在超聲功率為350 W時，對α-葡萄糖苷酶的抑制率最高為53.9%，這是由于隨著超聲波功率的增大，提取液各分子動能增加，超聲波的空穴效應得到加強，使得降糖物質(zhì)的溶出速度加快。但隨著超聲功率的繼續(xù)增大，降糖效果又有所下降，這可能是因為超聲功率過高，分子運動過于劇烈，加強了降糖物質(zhì)和其他成分之間的反應而使其遭到破壞，導致降糖效果下降[9]。故對于α-淀粉酶而言，超聲功率選擇200、300、350 W進行正交試驗，而α-葡萄糖苷酶而言，超聲功率選擇300、350、400 W用于進一步優(yōu)化。

圖3 超聲溫度對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性抑制率的影響Fig.3 Effects of ultrasonic temperature on inhibition rate of α-amylase and α-glucosidase

圖4 超聲功率對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性抑制率的影響Fig.4 Effects of ultrasonic power on inhibition rate of α-amylase and α-glucosidase

2.2 正交試驗

影響桑葚渣水提液降糖活性的因素不是孤立的，它們之間是相互關聯(lián)的。現(xiàn)選擇超聲時間(A)、料液比(B)、超聲溫度(C)、超聲功率(D)4個因素進行4因素3水平的正交試驗，以α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶為指標，確定最佳的工藝條件。正交試驗各個因素水平設置見表3、表4。

以α-淀粉酶的抑制活性為指標，用正交試驗對桑葚渣α-淀粉酶抑制劑提取工藝條件進行優(yōu)化，正交試驗結(jié)果與分析見表5，方差分析結(jié)果見表6。

正交試驗結(jié)果如表5所示。影響α-淀粉酶的抑制活性的因素依次為超聲時間>料液比>超聲溫度>超聲功率，對α-淀粉酶的抑制活性最佳的提取條件為A2B2C3D2，即超聲時間1.5 h，料液比1∶40(g·mL-1)，超聲溫度70 ℃，超聲功率350 W。在此最優(yōu)條件下進行3次驗證試驗，所得的桑葚水提液對α-淀粉酶的抑制率為78.6%。

表3以α-淀粉酶為指標的正交試驗因素水平表

Table3Orthogonal test factor table with alpha-amylase as index

水平LevelA超聲時間Ultrasonic time/hB料液比Solid-liquidratio/(g·mL-1)C超聲溫度Ultrasonic temperature/℃D超聲功率Ultrasonic power/W11.01∶305030021.51∶406035032.01∶5070400

表4以α-葡萄糖苷酶為指標的正交試驗因素水平表

Table4Orthogonal test factor table with alpha-glucosidase as index

水平LevelA超聲時間Ultrasonic time/hB料液比Solid-liquidratio/(g·mL-1)C超聲溫度Ultrasonic temperature/℃D超聲功率Ultrasonic power/W11.01∶205020021.51∶306030032.01∶4070350

表5對α-淀粉酶的提取工藝優(yōu)化正交試驗結(jié)果表

Table5Optimization of orthogonal test results for extraction process of alpha-amylase

試驗號TestNo.ABCDα-淀粉酶抑制率Inhibition rate ofa-amylase/%1111155.702122260.653133356.284212366.715223170.456231264.507313248.808321350.519332145.33k157.5457.0755.9057.16k267.2259.5457.5657.98k347.2155.3758.5156.83R9.335.171.610.15

由表6的方差分析可知：在各個因素中，超聲時間對α-淀粉酶的抑制率的影響極顯著，料液比對α-淀粉酶抑制率的影響比較顯著，而提取溫度、超聲功率對α-淀粉酶抑制率的影響不顯著。

以α-葡萄糖苷酶的抑制活性為指標，用正交試驗對桑葚渣α-葡萄糖苷酶抑制劑提取工藝條件進行優(yōu)化，正交試驗結(jié)果與分析見表7，方差分析結(jié)果見表8。

正交試驗結(jié)果如表7所示。影響α-葡萄糖苷酶的抑制活性的因素依次為超聲時間>料液比>超聲溫度>超聲功率，對α-葡萄糖苷酶的抑制活性最佳的提取條件為A2B3C1D3，即超聲時間1.5 h，料液比1∶40(g·mL-1)，超聲溫度50 ℃，超聲功率350 W。在此最優(yōu)條件下進行3次驗證試驗，所得的桑葚水提液對α-葡萄糖苷酶的抑制率為81.4%。

由表8的方差分析可知，在各個因素中，超聲時間對α-葡萄糖苷酶的抑制率的影響極顯著，料液比、提取溫度對α-葡萄糖苷酶抑制率的影響顯著，而超聲功率對α-葡萄糖苷酶抑制率的影響不顯著。

表6正交試驗結(jié)果方差分析

Table6Variance analysis of orthogonal experiments results

方差來源Source of varianceABCD誤差Error 總和Total 離差平方和Sum of squares of deviations541.94 41.60 3.91 1.15 1.15 588.61自由度 Freedom2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 8.00 均方Mean square270.97 20.80 1.96 0.58 0.58 F值F value469.72??36.06?3.39 1.00

**表示極顯著(P<0.01)；*表示顯著(P<0.05)。下同。

** indicated extremely significant difference (P<0.01)；* indicated significant difference (P<0.05). The same as below.

表7α-葡萄糖苷酶的提取工藝優(yōu)化正交試驗結(jié)果表

Table7Optimization of orthogonal test results for extraction process of alpha-glucosidase

試驗號TestNo.ABCDα-葡萄糖苷酶酶抑制率Inhibition rate of alpha-glu-cosidase/%1111154.23 2122251.65 3133356.28 4212368.71 5223172.45 6231278.50 7313259.80 8321368.51 9332165.33 k154.05 60.91 67.08 64.00k273.22 64.20 61.90 63.32k364.55 66.70 62.84 64.50R19.17 5.79 5.18 1.18

3 結(jié)論

本實驗以桑葚渣為原料，以α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的抑制率為評價指標，考查超聲溫度、超聲時間、料液比、超聲功率對水提液抑制酶活性的影響。在單因素試驗結(jié)果的基礎上，采用正交試驗優(yōu)化超聲輔助提取的工藝參數(shù)，得出對于α-淀粉酶抑制率最佳的工藝參數(shù)為提取溫度70 ℃、超聲時間1.5 h、料液比1∶40(g·mL-1)和超聲功率350 W。α-葡萄糖苷酶抑制率最佳的工藝參數(shù)為提取溫度50 ℃、超聲時間1.5 h、料液比1∶40(g·mL-1)和超聲功率350 W。由于提取溫度對于α-淀粉酶抑制率的影響不顯著，對α-葡萄糖苷酶抑制率的影響比較顯著，因此提取溫度選擇50 ℃，以保證提取液對于兩種酶的抑制活性都較高。綜上，兩種酶抑制率最佳的工藝參數(shù)為提取溫度50 ℃、超聲時間1.5 h、料液比1∶40(g·mL-1)和超聲功率350 W，所得的桑葚渣提取液對α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的抑制率分別為76.4%、81.4%。研究結(jié)果可為工業(yè)化提取桑葚渣中的降糖功能因子、實現(xiàn)桑葚渣的高值化利用提供技術依據(jù)。

表8正交試驗結(jié)果方差分析

Table8Variance analysis of orthogonal experiments results

方差來源Source of varianceABCD誤差Error總和Total 離差平方和Sum of squares of deviations552.70 50.60 45.71 2.12 2.12 651.13 自由度 Freedom2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 8.00 均方Mean square276.35 25.30 22.86 1.06 1.06 F值F value260.90??23.88?21.58? 1.00