參葵通脈顆粒對(duì)慢性心衰大鼠模型心肌細(xì)胞焦亡及相關(guān)因子的影響?

嚴(yán)士海，王 晗，李 婕，潘海敏

(江蘇省中醫(yī)院，南京 210029)

慢性心衰(chronic heart failure，CHF)是以心臟功能減退為特征的一系列臨床綜合征，盡管有多種治療方案，CHF患者的發(fā)病率和死亡率仍然達(dá)到大流行比例，其治療與機(jī)制研究吸引眾多研究者[1-2]。細(xì)胞焦亡是一種程序性細(xì)胞死亡方式，其特征為依賴于半胱天冬酶1(Caspase 1)，并伴有大量促炎癥因子的釋放，在CHF中的作用受到大家關(guān)注[3-4]。參葵通脈顆粒(由炙黃芪、靈芝、淫羊藿、桂枝、丹參、黃蜀葵花等組成)是項(xiàng)目組傳承國(guó)醫(yī)大師周仲瑛教授臨床經(jīng)驗(yàn)而創(chuàng)制的醫(yī)院制劑。前期臨床與實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，參葵通脈顆粒總有效率90.32%，顯著高于對(duì)照組的80.32%，能夠抑制心肌重塑，抗免疫炎癥反應(yīng)[5-8]。本論文研究了參葵通脈顆粒對(duì)CHF大鼠模型心肌焦亡的影響，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與飼養(yǎng)方法

12周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠100只，體質(zhì)量(230±20) g，由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(蘇)2017-0007)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于江蘇省中醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，室溫(22±2)℃，常規(guī)喂食，自由飲水，12 h/12 h光照/黑夜，相對(duì)濕度 40%～50%。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵守江蘇省中醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理操作規(guī)程。

1.2 藥物與試劑

參葵通脈顆粒組成：炙黃芪20 g，靈芝20 g，仙靈脾10 g，桂枝10 g，丹參10 g，黃蜀葵10 g，茯苓10 g，陳皮6 g，由江蘇省中醫(yī)院制劑部制備生產(chǎn)(生產(chǎn)批號(hào)20171012)。陽性藥為鹽酸貝那普利，北京諾華制藥有限公司生產(chǎn)(批號(hào)X2632)。兔抗大鼠TLR4、NF-κB、Caspase 1、IL-1β抗體，購自abcam公司；N末端B型利鈉肽原(NT-proBNP)試劑盒，購自奧森多醫(yī)療器械貿(mào)易(中國(guó))有限公司。

1.3 造模方法

參考課題組前期實(shí)驗(yàn)方法[8-9]，采用腎上腹主動(dòng)脈縮窄法制備CHF大鼠模型，使大鼠腹主動(dòng)脈直徑減少40%～50%。另取同源SD大鼠，僅游離腹主動(dòng)脈但不縮窄，其他操作與模型組相同，作為假手術(shù)組。

1.4 分組與給藥干預(yù)

假手術(shù)組和模型組給予等體積蒸餾水。參葵通脈顆粒低劑量組(0.72 g顆粒/kg)劑量為人臨床等效劑量的1/2，參葵通脈顆粒中劑量組(1.44 g顆粒/kg)劑量為人臨床等效劑量，參葵通脈顆粒高劑量組(2.88 g顆粒/kg)劑量為人臨床等效劑量的2倍，陽性藥組(貝那普利，0.9 mg/kg)劑量為人臨床等效劑量。造模成功后，根據(jù)上述分組灌胃給于相應(yīng)組別藥物共4周。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1 心功能檢測(cè) 大鼠禁食不禁水過夜，末次給藥后2 h稱體質(zhì)量(g)，然后將大鼠以異氟烷吸入性麻醉后，應(yīng)用小動(dòng)物高頻彩色超聲系統(tǒng)(加拿大VISUALSONICS)測(cè)量左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricle ejection fraction, LVEF)和縮短分?jǐn)?shù)(fractional shortening, FS)，測(cè)定值為3個(gè)心動(dòng)周期的均值。

1.5.2 標(biāo)本采集 檢測(cè)大鼠血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)后，從頸總動(dòng)脈采集2 mL血液，3000 r/min、10 min離心分離血清以備檢測(cè)；然后快速剪開胸腔取出心臟，用生理鹽水清洗2次濾紙吸干，沿房室溝剪掉兩心房、主動(dòng)脈和肺動(dòng)脈，緊貼室間隔右側(cè)剪下右心室游離壁，剩余部分即為左心室。沿著左心室中部橫向切取0.5 cm厚的心肌組織置于4%多聚甲醛中固定以備染色。剩余左心室組織包于錫紙中，標(biāo)記并立即放入液氮速凍24 h，然后置于-80 ℃冰箱貯藏，用于Western blot等檢測(cè)。

1.5.3 NT-proBNP檢測(cè) 樣本送醫(yī)院檢驗(yàn)科，使用強(qiáng)生Vitro5600全自動(dòng)生化免疫分析儀檢測(cè)NT-proBNP。

1.5.4 TUNEL染色 經(jīng)過固定的組織梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋切片，按照試劑盒說明嚴(yán)格進(jìn)行操作。用TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞程序性壞死，以細(xì)胞核染成棕褐色為陽性結(jié)果，每組每個(gè)心肌標(biāo)本各取1張切片，每張切片計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野(×400)，計(jì)算心肌細(xì)胞TUNEL 蛋白指數(shù)(陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))。

1.5.5 western blot檢測(cè)TLR4、NF-κB、caspase1、IL-1β的表達(dá) 根據(jù)說明書提取左心室總蛋白，采用BCA 法定量蛋白。采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，染色觀察條帶，緩沖溶液洗膜，采用封閉液封閉1 h，分別加兔抗大鼠TLR4、NF-κB、Caspase 1、IL-1β抗體稀釋液室溫孵育2 h，緩沖溶液洗膜，加二抗反應(yīng)1 h，緩沖溶液洗膜，ECL 發(fā)光試劑發(fā)光。采用凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行吸光度掃描，將TLR4、NF-κB、Caspase 1、IL-1β蛋白條帶的吸光度與β-actin比值作為蛋白表達(dá)值進(jìn)行比較。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 參葵通脈顆粒對(duì)CHF大鼠模型LVEF與FS的影響

表1顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠 LVEF與FS顯著降低；與模型組比較，參葵通脈顆粒低、中、高3個(gè)劑量組LVEF與FS明顯增加。

表1 參葵通脈顆粒對(duì)CHF大鼠LVEF與FS的影響

注：與假手術(shù)組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

2.2 參葵通脈顆粒對(duì)NT-proBNP的影響

表2顯示，與假手術(shù)組比較，模型組NT-proBNP顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，參葵通脈顆粒低、中、高3個(gè)劑量組NT-proBNP顯著降低(P<0.05)。

2.3 參葵通脈顆粒對(duì)心肌TUNEL染色的影響

表2圖1顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠TUNEL染色陽性細(xì)胞(棕色顆粒)顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，參葵通脈顆粒各組TUNEL染色陽性細(xì)胞顯著降低(P<0.05)。

2.4 參葵通脈顆粒對(duì)TLR4、NF-κB、Caspase 1、IL-1β的影響

表3顯示，與假手術(shù)組比較，模型組TLR4、NF-κB、Caspase 1、IL-1β蛋白表達(dá)水平顯著升高；與模型組比較，參葵通脈顆粒各組TLR4、NF-κB、Caspase 1、IL-1β蛋白表達(dá)水平顯著下降。

表2 參葵通脈顆粒對(duì)CHF大鼠NT-proBNP、TUNEL蛋白指數(shù)的影響

注：與假手術(shù)組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

注：a.假手術(shù)組；b.模型組；c.參葵通脈顆粒低劑量組；d.參葵通脈顆粒中劑量組；e.參葵通脈顆粒高劑量組；f.貝那普利組圖1 各組心肌TUNEL染色比較(×400)

3 討論

根據(jù)CHF臨床癥狀，國(guó)醫(yī)大師周仲瑛提出[10]CHF治療應(yīng)當(dāng)辨別虛實(shí)標(biāo)本，其病理發(fā)展則多為心氣虛弱、心陽不振、氣虛陽衰、血瘀水停。由此可知，“氣陽虧虛”是心力衰竭的病理基礎(chǔ)，“心脈瘀滯”是心力衰竭的中心環(huán)節(jié)，并以心氣(陽)虧虛、血瘀(水停)為其病理變化的主要方面。項(xiàng)目組傳承周仲瑛教授的臨床經(jīng)驗(yàn)，創(chuàng)制參葵通脈顆粒——以益氣(溫陽)、化瘀(利水)為主要功效的中藥復(fù)方制劑。

本研究復(fù)制CHF大鼠模型發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，模型組NT-proBNP顯著上升，LVEF與FS明顯下降，說明大鼠心肌功能受損，CHF模型復(fù)制成功[11]。經(jīng)過藥物治療后，與模型組比較參葵通脈顆粒各組NT-proBNP明顯下降，LVEF與FS顯著上調(diào)，說明參葵通脈顆粒對(duì)CHF大鼠模型心肌功能損傷具有良好的改善作用。

細(xì)胞焦亡是一種主要由Caspase 1介導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡模式，與凋亡特征相似的地方是焦亡過程中DNA斷裂和TUNEL染色呈陽性。與細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞膜完整和凋亡小體形成的過程不同，焦亡一般伴隨著大量的免疫炎癥因子與細(xì)胞內(nèi)容物的釋放。本實(shí)驗(yàn)TUNEL染色結(jié)果顯示，參葵通脈顆粒對(duì)心肌細(xì)胞程序性死亡具有較好的抑制作用。Caspase 1與IL-1β是細(xì)胞焦亡過程中重要的炎癥因子，IL-1β在CHF的發(fā)病過程中起到非常重要的作用，一方面能誘發(fā)心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)中的鈣離子外流，直接影響鈣離子的內(nèi)環(huán)境以及心肌細(xì)胞興奮-收縮偶聯(lián)，使心肌收縮功能受損；另一面還能引起細(xì)胞死亡和組織重塑，導(dǎo)致心衰發(fā)生[12-14]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，參葵通脈顆粒能夠顯著降低CHF大鼠模型心肌組織中Caspase 1與IL-1β水平，說明參葵通脈顆粒可能通過調(diào)控心肌細(xì)胞焦亡，發(fā)揮益氣溫陽、化瘀利水的作用，進(jìn)而干預(yù)CHF抑制心肌重構(gòu)的病理過程，達(dá)到防治CHF的效果。Toll樣受體是細(xì)胞膜上的分子模式識(shí)別受體，當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激或體內(nèi)神經(jīng)內(nèi)分泌紊亂等刺激時(shí)，TLR4能夠識(shí)別內(nèi)環(huán)境的變化，通過NF-κB促進(jìn)caspase-1、IL-1β前體的表達(dá)[15-16]。本研究觀測(cè)到，模型組大鼠心肌TLR4、NF-κB表達(dá)顯著增加，與其他研究者結(jié)果一致，而且結(jié)果顯示參葵通脈顆粒可以一定程度上抑制TLR4、NF-κB的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，參葵通脈顆粒既可以從源頭上抑制caspase-1、IL-1β前體的產(chǎn)生，也可以抑制caspase-1、IL-1β的活化。

綜上所述，參葵通脈顆粒對(duì)CHF大鼠模型心功能與心肌重塑具有良好的改善作用。CHF大鼠心肌細(xì)胞焦亡明顯增加，參葵通脈顆粒對(duì)CHF大鼠心肌細(xì)胞焦亡及焦亡通路相關(guān)蛋白的表達(dá)具有一定的抑制作用，這可能與其治療CHF、減輕心肌重塑密切相關(guān)。

表3 參葵通脈顆粒對(duì)TLR4、NF-κB、Caspase 1、IL-1β的影響

注：與假手術(shù)組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05