葛根素對輕型復發性口腔潰瘍三種中醫證型T淋巴細胞亞群的影響?

王春風，羅 瓊，金 玲，周麗玲

(1. 湖南醫藥學院，湖南 懷化 418000； 2. 湖南中醫藥大學附屬第一醫院，長沙 410007)

復發性口腔潰瘍(recurrent oral ulcer, ROU)是口腔黏膜病中的常見病，好發于口腔黏膜角化程度較差的部位，具有自限性、周期性、反復發作特點的孤立圓形或橢圓形潰瘍，發作時劇烈燒灼疼痛，嚴重影響患者的說話和進食，目前其病因及發病機制尚未明確，西醫認為與機體免疫功能失常有關[1-2]。中醫理論認為ROU屬于“口瘡”“口糜”等范疇，舌乃心之苗也，脾開竅于口部，齒齦、兩頰屬于大腸、胃，而督脈、任脈上絡于唇舌、口腔，其發病機制與脾、心、腎密切相關，臨床必須采取中醫的辨證施治[3]。但是對不同中醫證型ROU與外周血T淋巴細胞亞群之間關系的研究文獻較少[4-5]。葛根素(Puerarin)又名普樂林，別稱黃豆苷元8-C-葡萄糖甙，化學名4, 7 -二羥基-8-β -D-葡萄糖基異黃酮，是從豆科植物野葛(Puerrarialobata)的干燥根中提取制成的一種白色針狀結晶粉末藥粉，主要劑型有片劑、注射劑等。中醫研究證實，葛根素歸脾胃經，有升陽、活血、通絡的作用，具有提高機體免疫力、增強心肌收縮力、抗氧化應激、抗炎、抗過敏、改善微循環等多種生物學作用，廣泛應用于臨床各個領域[6-7]。因此，本文擬通過檢測葛根素對心脾積熱型、陰虛火旺型和氣血虧虛型3種中醫證型ROU患者治療前后外周血T淋巴細胞亞群數量及比值,探討3種不同中醫證型ROU與外周血T淋巴細胞亞群之間的關系及葛根素對3種不同中醫證型ROU患者的免疫調節作用，為臨床口腔醫師合理用藥防治復發性口腔潰瘍提供參考。

1 資料與方法

1.1 病例選擇及中醫辨證分組

表2顯示，選取2015年5月至2016年5月我院附屬第一醫院口腔科明確診斷為輕型復發性口腔潰瘍患者，且本次發病3 d內就診，經院倫理委員會批準、知情同意的200 例,年齡18～70歲,病程 0.6～20年的患者作為研究對象，分為葛根素治療組150例和陽性對照組50例。其中150例葛根素治療組又按照2012版《中醫病證診斷療效標準》口瘡的診斷依據、證候分類進行辨證分型分為3組[8]心脾積熱型組51例，其中男22 例、女29例，年齡(48.52±10.34)歲，口內疼痛、口渴、口臭、尿短黃、便秘、口瘡數量多、周圍充血明顯、舌紅苔黃、脈數。陰虛火旺型組58例，其中男 24例、女34例，年齡(47.49±10.28) 歲，口內疼痛、口干、手足心熱、乏力、口瘡1～2個或2～3個、周圍輕微充血、舌紅苔少、脈細數。氣血虧虛型41例，其中男16例，女25例，年齡(48.30±10.12) 歲，口不渴，或伴畏寒、便溏、口瘡數量不多、周圍黏膜不充血、舌淡苔薄白、脈細弱。余下50例男 20例，女30例，年齡(46.34±9.79) 歲的輕型ROU患者，由于只做常規且較安全的維生素B2和維生素C安慰治療，所以不分型，作為陽性對照組。另選同期健康者50例作為陰性對照組，其中男23例，女27例，年齡(47.82±10.65)歲。5組對象在年齡、性別等一般資料方面比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 診斷及排除標準

1.2.1 西醫診斷標準 根據衛生部“十二五”規劃教材《口腔黏膜病學》第4版ROU診斷標準[9]:病程>=半年； 潰瘍復發率>=1次/月；患者1個月內未服用任何治療ROU的藥物且本次發病至就診前未經任何治療。

1.2.2 排除標準 因應激、癌癥及創傷等引發的潰瘍；合并重要器官功能不全者、血液系統疾病及自身免疫系統疾病者； 妊娠及哺乳期婦女;不積極配合治療者或有精神障礙者。

1.3 治療方法

陽性對照組50例ROU患者即常規純西藥治療組：局部常規潰瘍軟膏涂敷，全身每天口服維生素B2和維生素C片(每片100 mg)；葛根素治療組150例ROU患者(心脾積熱型組、陰虛火旺型組和氣血虧虛型組)在此基礎上加服葛根素片(桂林制藥有限責任公司,每片50 mg)，每次2片,每日3次,7 d為1個療程，共2個療程14 d，隨診12個月。檢測治療前后T淋巴細胞亞群數量及比值，觀察并評價其中醫證候體征、療效和不良反應。

1.4 觀察指標

1.4.1 治療前后T 細胞亞群測定 所有標本均于就診當天和用藥14 d后各采集肘靜脈血1次。取100 μL EDTA抗凝外周血20 μL 加Anti-Human CD3+/ CD4+/ CD8+, PE-CY5/FITC/PE標記抗體(由晶美生物工程有限公司提供，批號LHK 301-050)混勻，室溫孵育25 min, 紅細胞裂解液溶解紅細胞,流式細胞儀(美國 B D 公司生產的 FACSCalbur 型流式細胞儀)檢測外周血CD3+、CD4+、CD8+細胞數量及比值。

1.4.2 中醫證候體征觀察及分級量化標準 表1顯示，參考《中藥新藥臨床研究指導原則》[10]對ROU患者進行中醫證候體征分級量化。

表1 中醫證候體征分級量化標準

注：潰瘍大小以最大潰瘍為準

1.5 療效評定標準

1.5.1 中醫證候體征短期療效評定標準 臨床痊愈：患者臨床癥狀、體征完全消失或基本消失，中醫證候積分較治療前減少≥95%； 顯效：患者臨床癥狀、體征均有明顯改善，中醫證候積分較治療前減少≥70%； 有效：患者臨床癥狀、體征均有好轉，中醫證候積分較治療前減少≥30%； 無效：患者臨床癥狀、體征基本無好轉，中醫證候積分較治療前減少<30%。采用尼莫地平法進行計算：(治療前積分-治療后積分)÷治療前積分×100%。

1.5.2 遠期臨床療效評價 根據中華口腔醫學會口腔黏膜病專業委員會制定的ROU評價試行標準[11]，采用全身治療療效評價試行標準-IN分級法對ROU患者進行遠期臨床療效評價。

全身治療療效評價指標：評價時段無潰瘍時間總和(I)，潰瘍數目總和(N)。評價指標分級：I1為總間歇期延長，I0為總間隙期無改變；N1為總潰瘍數減少，NO為總潰瘍數無改變。評價標準：口腔潰瘍終止復發6個月以上痊愈，I1N1為顯效，I1NO或ION1為有效，ION0為無效 (總有效率=(顯效例數+有效例數)÷該組總例數× 100%)。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 治療前各組年齡、性別等方面均衡性比較

表2顯示，5組在年齡、性別等一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

表2 治療前實驗組與對照組均衡性檢驗比較

注： 年齡和病程比較采用t檢驗，性別比較采用χ2檢驗

2.2 治療前后T細胞亞群比較

表3顯示，心脾積熱型ROU組在治療前CD4+及CD4+/CD8+低于陰性對照組(P<0.05)，CD8+高于陰性對照組(P<0.05),治療后CD4+及CD4+/CD8+明顯回升(P<0.05)，CD8+明顯下降，其余各組治療前后組間及組內比較差異無統計學意義(P>0.05)。

表3 治療前后心脾積熱型組、陰虛火旺型組、氣血虧虛型組、陽性對照組、陰性對照組T細胞亞群比較

注：治療前與陰性對照組比較：*P<0.05; 治療后與自身治療前比較：#P<0.05

2.3 治療前后中醫證候體征積分比較

表4顯示，治療前心脾積熱型、 陰虛火旺型、 氣血虧虛型3組中醫證候體征與陽性對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。但治療后心脾積熱型患者的潰瘍大小、潰瘍充血、水腫程度、燒灼感、口干口渴、大小便及舌象方面的中醫證候體征積分較治療前明顯得到改善，差異有統計學意義(P<0.05)；而陰虛火旺型、 氣血虧虛型、 陽性對照組治療后中醫證候體征積分雖較治療前減小，但差異無統計學意義(P>0.05)。

表4 治療前后中醫證候體征積分比較

注：治療前與陽性對照組比較:#P<0.05；治療前后與自身比較:*P<0.05

2.4 中醫證候療效比較

表5顯示，51例心脾積熱型組ROU患者，葛根素治療后中醫證候痊愈 26例，顯效12例，有效10例，無效3例，總有效率94.1%, 與陰虛火旺型組、氣血虧虛型組及陽性對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)，其余組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.5 遠期臨床療效比較

表6顯示，評價時段51例心脾積熱型組ROU患者，葛根素治療后顯效29例，有效17例，無效5例，總有效率90.2%, 與陰虛火旺型組、氣血虧虛型組及陽性對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)，其余組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。

表5 中醫證候療效比較

注：實驗數據用χ2檢驗進行統計分析，心脾積熱證組與其他3組比較:*P<0.01

表6 遠期臨床療效評價

注：實驗數據以χ2檢驗進行統計分析，心脾積熱證組與其他3組比較:*P<0.01

2.6 不良反應

治療期間共有3例首日出現體溫輕度升高、失眠等癥狀，但癥狀較輕，對癥處理后癥狀逐漸消失，未發生嚴重的藥物不良反應。

3 討論

ROU病因復雜，西醫研究表明約20% ROU患者外周血中存在明顯的T淋巴細胞亞群不平衡和功能缺陷，ROU的發病與T細胞免疫功能紊亂有關。其中CD3+為全T淋巴細胞，CD4+、CD8+是細胞免疫調節中樞，CD4+的輔助作用和CD8+的抑制作用及兩者的適當比例對于穩定和調節免疫系統的生理功能和免疫反應強度起重要作用。其機制可能在于，T 淋巴細胞免疫功能異常造成機體和局部細胞免疫功能發生改變，口腔黏膜上皮完整性受到損傷，進而出現口腔潰瘍[12-14]。

口腔潰瘍屬于中醫學“口瘡”范疇，為火熱之征，存在虛(陰虛火旺型組和氣血虧虛證型)、實(心脾積熱型)之分，以心脾積熱型口腔潰瘍患病比例最大，病機主要為心脾積熱，蘊而不散，循經上擾，火熱腐肉成瘡。口瘡雖生于口，但與心脾腎有密切相關，而脾腎功能又與機體的免疫功能密切相關。心脾積熱型ROU患者CD8+淋巴細胞升高，CD4+淋巴細胞和CD4+/CD8+比值降低，免疫功能狀態的失調可能是中醫證型動態性發展的病理基礎之一。在中醫辨證基礎上可以利用中藥的免疫調節作用，調整ROU患者的體質，提高ROU的治療效果[15-16]。

本項目組通過葛根素對心脾積熱型、陰虛火旺型和氣血虧虛型3種中醫證型的ROU患者治療前后外周血T淋巴細胞亞群數量及比值的檢測，發現3種中醫證型ROU患者治療前后外周血T淋巴細胞總數不變；但是心脾積熱型ROU組在治療前CD4+及CD4+/CD8+低于陰性對照組，CD8+高于陰性對照組，經葛根素治療后CD4+及CD4+/CD8+明顯回升，CD8+明顯下降，說明心脾積熱型組患者存在外周血CD4+、CD8+免疫細胞數量的異常及CD4+/CD8+比例的失衡，葛根素能有效增加心脾積熱型組ROU患者外周血CD4+細胞數量，減少CD8+細胞數量，使CD4+/CD8+比例趨于平衡，對心脾積熱型ROU患者具有明顯的免疫調節作用。與陳遠東等[3,15]研究結果相同。進一步研究發現，葛根素還可明顯降低心脾積熱型ROU患者的潰瘍大小、充血、水腫程度、燒灼感、口干口渴、大小便及舌象方面的中醫證候體征積分，提高心脾積熱型ROU患者的中醫證候療效和遠期臨床療效。由此推測，心脾積熱型ROU的發生發展與CD4+/ CD8+比例失衡有關。一方面葛根素富含的黃酮類化合物能有效清除自由基，抑制肝脾組織的氧化損傷，并增強肝脾臟碳粒攝取功能,從而促進心脾積熱型ROU患者T淋巴細胞的免疫功能[17]；另一方面葛根素可能通過加強T淋巴細胞產生呼吸爆發作用,從而加強免疫細胞產生活性介質對病源微生物等的殺傷作用，調節心脾積熱型ROU患者的 T 淋巴細胞免疫功能，改善其相關中醫證候體征，提高臨床療效[18]。

在本研究過程中，由于考慮到陽性對照組只做常規的維生素B2和維生素C安慰治療，從倫理角度出發，對陽性對照組ROU患者并未作進一步的中醫辨證分型；另一方面，由于復發性口腔潰瘍的發病受多種因素影響，而本研究中卻只將ROU患者分為3種中醫證型進行研究，因此本研究結果對中醫藥評價ROU患者的科學價值方面可能存在一定的局限性。葛根素治療心脾積熱型ROU患者的具體機制有待今后在中醫整體觀念和辨證論治的指導下，進一步擴大樣本含量、細化分組和對照研究，進行全方位、多角度地深入探討研究和驗證。

葛根素作為一種高效、價廉、低毒的純天然藥物，可調節心脾積熱型ROU患者外周血CD4+/CD8+比例的平衡，從而改善其相關中醫證候體征，是一種有效治療心脾積熱型ROU患者行之有效的藥物。