S1PR2通過抑制AKT/GSK-3β減少高糖誘導的內皮增殖

彭暉 閭宏偉

(1中南大學湘雅三醫院醫學實驗中心，湖南 長沙 410000；2長沙縣星沙醫院)

在糖尿病的并發癥中，大血管和微血管病變是其主要并發癥，具有發生率高、致殘和致死率高等特點〔1〕,目前公認血管內皮功能障礙是糖尿病血管病變發生的始動因素和主要病理生理學基礎〔2〕。1-磷酸鞘氨醇(S1P)是鞘磷脂代謝的中間產物，同時也是一種重要的信號分子，S1P與靶細胞表面的特異性受體——1-磷酸鞘氨醇受體(S1PR)結合，通過結合不同的G 蛋白,進一步激活細胞內信號轉導通路從而產生廣泛的生物學效應，包括細胞的增殖、凋亡、遷移、血管生成等〔3,4〕。在本實驗課題組的前期研究發現高糖處理的內皮細胞S1PR2表達增加，活性氧(ROS)生成增加，一氧化氮(NO)生成減少，內皮細胞體外血管形成能力明顯減弱,通過下調S1PR2的表達，內皮細胞體外血管形成能力和NO生成明顯得以改善〔5〕，表明S1PR2與高糖誘導的內皮細胞功能紊亂相關，但S1PR2介導高糖培養的內皮細胞功能障礙的具體下游通路仍不清楚。本研究擬通過使用S1PR2特異性拮抗劑(JTE-013)下調S1PR2表達后，檢測高糖培養的內皮細胞的增殖，進一步探討在高糖誘導的內皮細胞中S1PR2的作用通路。

1 材料與方法

1.1材料 人脈靜脈內皮細胞(HUVECs)購自中國科學院細胞庫；DMEM低糖培養基購自Gibco公司,胎牛血清購自BD公司，p-GSK-3β兔單克隆抗體、GSK-3β兔單克隆抗體、AKT兔單克隆抗體、p-AKT兔單克隆抗體、β-catenin兔單克隆抗體、cyclin D1兔單克隆抗體購自Cell Signaling Technology公司，S1PR2兔單克隆抗體、GAPDH 兔單克隆抗體購自Protein Tech公司，IRDye 800CW 羊抗兔紅外染料購于美國LI-COR公司，JTE-013購于Cayman公司，CCK-8試劑盒購自日本同仁化學。

1.2實驗方法

1.2.1HUVECs 培養 在含10%胎牛血清、1%青霉素+1%鏈霉素的DMEM低糖培養基中HUVECs呈貼壁生長，放置于37℃，5%CO2培育箱中培養至80%融合狀態時，用0.25%的胰蛋白消化細胞并傳代,第4～10代細胞用于實驗。高糖培養內皮細胞:正常培養內皮細胞接近匯合狀，用無血清培養基同步化處理12 h后更換成含30 mmol/L高糖的培養基，即正常糖培養基(含5.5 mmol/L葡萄糖) 中加入24.5 mmol/L葡萄糖至終濃度為30 mmol/L為高糖培養。24.5 mmol/L甘露醇作為高滲對照，實驗分組為：正常組、甘露醇組、高糖組、高糖+JTE-013組(1 μmol/L，JTE-013組)。

1.2.2CCK-8檢測細胞存活率 將消化后的細胞制成細胞懸液，接種于96孔板中，每個孔總體積為100 μl，每個孔的細胞總數為5×103個，置于恒溫CO2箱中培養，待細胞貼壁后，細胞分組并進行相應的干預，每個組各設5個復孔。周圍的孔用磷酸鹽緩沖液(PBS)填充。干預合適的時間后，向每孔加入10 μl的CCK-8溶液(注意不要使孔中產生氣泡)，將培養板在培養箱內孵育2 h，用酶標儀測定在450 nm處的吸光值。

1.2.3Western印跡檢測p-GSK-3β、GSK-3β、AKT、p-AKT、β-catenin、cyclin D1、S1PR2、GAPDH蛋白表達 用新鮮配置的細胞裂解液裂解內皮細胞，收集細胞裂解液移至1.5 ml EP 管中，采用聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白定量試劑盒測定各組細胞裂解液中蛋白質含量。準備好每孔蛋白樣品30 μg，進行電泳分析，十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離膠選用濃度為10%，濃縮膠濃度為 5%，在Bio-Rad 電轉儀上轉膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗稀釋液按下列比例稀釋一抗〔S1PR2 抗體:1∶500，p-GSK-3β(ser9)抗體1∶1 000，GSK-3β抗體：1∶1 000,AKT抗體：1∶1 000，p-AKT(ser473)抗體：1∶1 000，β-catenin抗體：1∶1 000，cyclin D1抗體：1∶1 000，GAPDH抗體：1∶3 000〕,4℃孵育過夜，次日，IRDye 800CW 羊抗兔紅外染料(染料：二抗稀釋液=1∶10 000)室溫避光孵育1 h，TBST清洗3次后，將PVDF膜直接放于Odyssey雙色紅外激光成像系統顯影。 顯影結果經Image J 軟件進行灰度分析，計算每個蛋白條帶光度與相應內參的光度比值。

1.3統計學方法 采用SPSS18.0軟件進行單因素分析、獨立樣本t檢驗。

2 結 果

2.1高糖對內皮細胞S1PR2表達的影響 30 mmol/L高糖干預72 h后，內皮細胞S1PR2表達增加(P<0.05)。見表1，圖1。

表1 高糖對S1PR2、p-AKT/AKT、p-GSK-3β/GSK-3β、β-catenin、cyclin D1蛋白的影響

與正常組比較：1)P<0.05

圖1 高糖對內皮細胞S1PR2表達的影響

2.2S1PR2拮抗劑(JTE-013)對高糖誘導的內皮細胞存活率的影響 與正常組內皮細胞存活率〔(100.00±0.00%)〕比較，高糖引起內皮細胞存活率明顯降低〔(73.65±2.68)%，P<0.05〕；予JTE-013刺激后，高糖培養的內皮細胞存活率〔(87.20±4.72)%〕較高糖組明顯增加(P<0.05)。甘露醇組〔(96.05±3.79)%〕與正常組相比無明顯改變(P>0.05)。

2.3高糖對AKT/GSK-3β通路的影響 如表1，圖2，3，高糖組內皮細胞AKT和GSK-3β磷酸化蛋白水平均明顯減少,β-catenin、cyclin D1蛋白表達明顯減少(P<0.05)。甘露醇組與正常組相比無明顯改變(P>0.05)。

2.4下調S1PR2對AKT/GSK-3β通路的影響 如

表2，圖4，5所示，JTE-013刺激后高糖培養的內皮細胞AKT和GSK-3β磷酸化蛋白水平顯著增加，β-catenin、cyclin D1蛋白表達顯著增加(P<0.05)。

圖2 高糖對內皮細胞AKT/GSK-3β信號通路的影響

圖3 高糖對內皮細胞β-catenin、cyclin D1蛋白的影響

組別p-AKT/AKTp-GSK-3β/ GSK-3ββ-catenincyclin D1高糖組0.40±0.180.23±0.060.27±0.050.19±0.05JTE-013組0.81±0.111)0.61±0.131)0.48±0.051)0.43±0.041)

與高糖組比較：1)P<0.05

圖4 JTE-013對高糖干預下內皮細胞AKT/GSK-3β通路的影響

圖5 JTE-013對高糖干預下內皮細胞β-catenin、cyclin D1蛋白的影響

3 討 論

糖尿病是一種常見的慢性代謝性疾病，嚴重威脅人類健康。同時，心血管疾病是糖尿病最重要的并發癥及死因，而糖尿病血管病變具有發生率高、致殘和致死率高等特點。血管內皮功能障礙是糖尿病血管病變的始動因素。高血糖引起內皮一系列分子水平的變化，如線粒體功能障礙，氧化應激水平增加，內皮細胞的凋亡增加〔6,7〕，血管擴張劑與血管收縮劑前列腺素的產生失衡，這些改變均可加速內皮功能障礙的進程〔8〕。在本研究中證實高糖抑制內皮細胞的存活。

S1P是一種重要的信號分子，血漿中的S1P主要以結合形式存在，高密度脂蛋白(HDL)和白蛋白是其主要載體。S1P與糖尿病發生發展密切相關，有研究顯示2型糖尿病患者血清S1P水平明顯高于健康人群〔9,10〕。S1P與通過與靶細胞表面S1PR結合，激活細胞內信號轉導通路從而產生廣泛的生物學效應，在內皮細胞中，內皮細胞表面主要存在S1PR1、S1PR2和S1PR3三種受體的表達,S1P作用于S1PR2,通過激活Rho/ROCK/PTEN信號通路,抑制Rac蛋白活性,抑制內皮細胞遷移，破壞黏著連接點，同時引起細胞內鈣離子濃度升高，促進血管通透性增加，破壞內皮屏障〔11〕。本文用高糖干預臍靜脈內皮細胞，S1PR2表達增加，下調S1PR2后在內皮細胞存活率增加，說明S1PR2參與了高糖誘導的內皮細胞的增殖減少。下調S1PR2表達后,高糖干預后的內皮細胞的存活率增加。同時發現AKT/GSK-3β/β-catenin/cyclin D1通路中的蛋白均有表達變化，p-AKT、p-GSK-3β、β-catenin、cyclin D1蛋白表達均增加。

AKT作為細胞內的關鍵信號分子之一，在細胞增殖、遷移、分化、凋亡和物質代謝等一系列生理和病理進程中發揮重要調節作用〔12〕,在高糖作用下，S1PR2通過PI3K/AKT/eNOS通路減少NO的生成，引起內皮舒張功能障礙〔13〕。Akt能磷酸化GSK-3β,拮抗β-catenin的降解，使其濃度升高，通過下調E-鈣黏素表達，降低細胞的黏附能力〔14〕，在心肌細胞中Akt通過激活GSK-3β/β-catenin信號通路保護高脂誘導的細胞凋亡〔15〕。

在S1P與GSK-3β的研究中，既往發現S1P類似物FTY720能通過抑制GSK-3β，調節線粒體通透性轉換孔的開放，保護糖尿病心臟缺血再灌注損傷〔16〕。S1P通常結合于靶細胞表面的S1P受體激活細胞內信號通路，在該實驗中尚未進一步研究FTY720抑制GSK-3β表達的具體作用S1PR。在本實驗中首次發現，在臍靜脈內皮細胞中，S1PR2通過激活下游GSK-3β參與高糖誘導的內皮功能障礙。

GSK-3β、β-catenin為Wnt經典信號通路中的重要蛋白分子，廣泛存在于各種類型的細胞,如內皮細胞、成纖維細胞、成骨細胞中，調控細胞生長、分化和凋亡等〔17〕，如在高糖高脂干預的主動脈內皮細胞中，細胞GSK-3β表達增加，抑制GSK-3β能增加基礎自噬及激活AMPK信號，改善內皮功能〔18〕；在高糖刺激下，Wnt/β-catenin信號通路可以調節人臍靜脈內皮細胞和腎小球系膜細胞的存活和增殖,促進血管新生，提高β-catenin及p-GSK-3β(Ser9)的表達，抑制GSK-3β的表達，能降低高糖引起的細胞凋亡〔19,20〕。在本實驗中，高糖干預下β-catenin表達減少,拮抗S1PR2后β-catenin表達增加,考慮JTE-013通過激活AKT/GSK-3β/β-catenin通路，促進高糖干預的內皮細胞的增殖。

cyclin D1是Wnt/β-catenin信號通路下游的一個靶基因〔21〕，cyclin D1是細胞由G1 期向S期轉換的重要限速因素，其表達可以直接影響到細胞的增殖〔22,23〕。在本實驗中發現高糖干預下，cyclin D1表達降低，下調S1PR2能引起cyclin D1的表達增加。因此，綜上所述，S1PR2可能通過AKT/GSK-3β/β-catenin/cyclin D1，影響內皮細胞增殖。

簡言之，本研究結果顯示S1PR2參與高糖誘導的內皮細胞增殖降低，下調S1PR2后上述內皮細胞功能得以明顯改善，激活AKT/GSK-3β/β-catenin/cyclin D1信號通路可能是S1PR2 抑制劑改善高糖誘導內皮細胞損傷的作用機制之一。