雷公藤內酯醇對小鼠H22腹水瘤細胞凋亡及PD-L1表達的影響

鄒玉蓮， 黃秀旺， 甘陳靈

近年來，癌癥已被列為影響中國居民健康的第一病因。傳統的臨床一線抗癌藥物如5-氟尿嘧啶、紫杉醇、長春新堿等，已表現出越來越高的藥物耐受率[1-3]，且大劑量使用化療藥物往往加重機體免疫功能的破壞，腫瘤細胞更易發生免疫逃逸。負性調控因子程序性死亡受體-配體1(programmed cell death-Ligand 1, PD-L1)是最重要的免疫抑制分子，其過表達是介導腫瘤免疫逃逸的關鍵機制[4]。5-氟尿嘧啶等化療藥物可以誘導人腫瘤細胞PD-L1的表達，誘導T細胞凋亡進而介導腫瘤免疫逃逸，這無疑為經典的化學藥物治療又蒙上一層陰影[5-6]。雷公藤內酯醇(triptolide，TPL)又名雷公藤甲素，是從雷公藤中分離出的環氧二萜內酯化合物，是雷公藤的主要有效成分之一，具有抗炎、抑制生育、調節免疫反應等藥理作用。自Kuchan等首次發現TPL的抗腫瘤活性以來[7]，人們對TPL治療腫瘤的功效做了大量的研究。體內外實驗顯示其具有較強及廣譜的抗腫瘤作用，對鱗狀細胞癌、結腸癌、膽囊癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、腎癌、肺癌等多種癌細胞都有較好的療效[8-9]。研究提示，TPL可以誘導腫瘤細胞凋亡，且小劑量TPL即可抑制多種腫瘤細胞的生長[10-11]。體外實驗表明，TPL可以下調γ-干擾素誘導的PD-L1表達[12-13]。本研究以H22小鼠腹水瘤為研究對象，探討TPL抗肝癌的作用機制，為TPL在臨床上用于防治肝腫瘤提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1藥物、主要試劑與儀器 雷公藤內酯醇購自南京澤朗生物科技有限公司，純度為99%，分子量為360.4；于實驗前以丙二醇(1 mg/mL)新鮮配制。RPMI 1640培養基(美國Corning公司)；1640培養基(美國GEMINI公司)；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒(瑞士 Roche公司)；PD-L1(美國eBioscience公司)。CO2生物培養箱(Forma371)、酶標儀(Varioskan Flash)及高速冷凍離心機(Heraeus Multifuge X1R)(美國Thermo公司)；流式細胞儀(FACS Verse，美國BD公司)。

1.1.2動物與細胞 C57BL/6小鼠，雌性，體質量18～22 g[上海斯萊克實驗動物有限公司，合格證號：SCXK(滬)2012-0002]，飼養在清潔級環境中。飼養1周后進行實驗，每日12 h 光照維持，晝夜循環。小鼠肝癌H22細胞株購買于中科院上海細胞所。

1.2方法

1.2.1小鼠H22 腹水瘤模型的建立 取對數生長期的H22細胞，用RPMI 1640培養液制成每毫升含1.5×107細胞的懸液，取0.2 mL腹腔注射于2只C57BL/6小鼠。接種后第10天，抽取小鼠的腹水，用PBS制成每毫升含1.5×107細胞的懸液，取0.2 mL分別腹腔注射于80只小鼠，作為實驗第1天。

1.2.2分組及給藥方法 將80只H22腹水瘤小鼠隨機分為對照組及TPL低、中、高劑量組，每組20只(15只用于生存期觀察，另外5只用于檢測其他指標)：實驗第3天起，TPL低、中、高劑量組分別隔日尾靜脈注射TPL 0.05，0.1，0.2 mg/kg，對照組隔日尾靜脈注射等量2%丙二醇溶液。

1.2.3小鼠體質量及生存期 隔日記錄各組小鼠的體質量變化情況和生存時間，并繪制體質量曲線和生存期曲線。

1.2.4小鼠腹水體積和腹水中腫瘤細胞數 第14天，各組隨機處死5只小鼠，抽取腹水，計量體積，用PBS將腹水稀釋10倍，檢測細胞密度，計算腹水中的腫瘤細胞數。

1.2.5檢測細胞凋亡 取1.2.4中的腹水，離心收集細胞，PBS洗滌2次，按照羅氏公司AnnexinV-FITC/PI雙染試劑盒說明書處理，流式細胞術檢測。細胞凋亡率計算方法：

細胞凋亡率(%)=(早期凋亡細胞+晚期凋亡細胞)/全部細胞數×100%

Annexin V陽性/PI陰性表示早期凋亡，Annexin V陽性/PI陽性表示晚期凋亡。

1.2.6流式細胞儀檢測細胞PD-L1的表達 腹水標本處理同上，收集細胞至流式管中，2 000 r/min離心3 min，棄上清，向各流式管中加入2 mL流式液(含1%血清的PBS溶液)重懸細胞，2 000 r/min離心3 min，棄上清，輕輕將管底細胞懸起，各管加入抗體，4 ℃孵育20 min后，加入2 mL流式液，2 000 r/min離心3 min，棄上清，各管加入300 μL流式液，上機檢測。

2 結 果

2.1小鼠體質量和生存期變化情況 接種H22腹水瘤后前6天，對照組小鼠的腹水和體質量增加迅速，小鼠進食狀況及精神狀態較好；第7天后小鼠進食減少，精神欠佳，活動減少；第11天后小鼠腹部膨脹；第13天對照組小鼠逐步開始死亡，到第19天小鼠全部死亡。與對照組比較，TPL各組小鼠的進食及精神狀態良好，腹水和體質量增長緩慢，尤以中、高劑量組最明顯。給藥組小鼠第16天開始死亡，直至第22天全部死亡(圖1)。

對照組和TPL低、中、高劑量組小鼠的中位生存期分別為14，17，20和20 d。與對照組比較，TPL各劑量組的生存期均有明顯延長(P<0.05，P<0.01，表1)。其中，中、高劑量組較低劑量組延長(P<0.05)，但是中、高劑量組間比較，差別無統計學意義(P>0.05)。

TPL：雷公藤內醇酯. A：TPL對腹水瘤小鼠體質量的影響；B：TPL對腹水瘤小鼠生存期的影響.圖1 TPL對腹水瘤小鼠體質量和生存期的影響Fig 1 Effects of TPL on the weight and survival of ascites tumor mice

分 組ρTPL/(mg·kg-1)mOS/d95% CI對照組01414.08～15.78TPL低劑量組0.0517☆16.95～18.26TPL中劑量組0.120☆☆18.32～20.21TPL高劑量組0.220☆☆18.75～20.31

n=15. TPL：雷公藤內酯醇； mOS：中位生存期；CI：置信區間. 與對照組比較，☆：P<0.05； ☆☆：P<0.01.

2.2TPL對小鼠腹水和腹水中腫瘤細胞數的影響 TPL各劑量組的腹水體積和每毫升腹水腫瘤細胞數較對照組減少(P<0.05，P<0.01，表2)，作用具有濃度依賴性。

表2TPL對腹水以及腹水腫瘤細胞數的影響。

Tab2Effects of TPL on the growth of ascites and the number of tumor cells in ascites

分 組ρTPL/(mg·kg-1)V腹水/mL腹水腫瘤細胞數(×108 mL-1)對照組013.9±1.6215.0±1.56TPL低劑量組0.0510.2±1.03☆10.5±1.46☆☆TPL中劑量組0.17.2±0.91☆☆8.3±1.23☆☆TPL高劑量組0.25.9±1.02☆☆7.1±1.22☆☆

n=5. TPL：雷公藤內酯醇. 與對照組比較，☆：P<0.05，☆☆：P<0.01.

2.3TPL對小鼠腹水中腫瘤細胞凋亡的影響 TPL各劑量組的腹水腫瘤細胞凋亡率均較對照組明顯增加，對照組、低、中、高劑量組的細胞總凋亡率分別為(11.08±4.12)%，(22.04±3.50)%，(32.38±4.47)%及(43.22±6.36)%，單因素方差分析表明，藥物濃度對細胞凋亡影響顯著，各組之間兩兩比較，差別具有統計學意義(圖2)。

2.4流式細胞術測定TPL對PD-L1的表達的影響 TPL低、中、高劑量組的H22細胞PD-L1蛋白表達水平明顯低于對照組(圖3)，單因素方差分析表明，藥物濃度對PD-L1表達影響顯著(P<0.01)，且TPL低、中、高劑量組 PD-L1蛋白表達兩兩比較差別亦有顯著性。隨著TPL藥物劑量增加，PD-L1表達水平降低，提示TPL可下調肝癌H22細胞PD-L1的表達，且其下調蛋白表達作用具有濃度依賴性。

TPL：雷公藤內醇酯. A：流式細胞技術分析；B：統計學分析. 不同濃度間比較，☆：P<0.05，☆☆：P<0.01.圖2 TPL對腹水瘤細胞凋亡的影響Fig 2 Effects of TPL on tumor cell apoptosis in mouse ascites

TPL：雷公藤內酯醇. A：流式細胞技術分析；B：統計學分析. 不同濃度間比較，☆：P<0.05，☆☆：P<0.01.圖3 TPL對腹水瘤細胞PD-L1蛋白表達的影響Fig 3 Effects of TPL on the expression of PD-L1 on tumor cell in mouse ascites

3 討 論

TPL是中藥雷公藤的主要有效成分之一，具有高效廣譜抗腫瘤的作用。目前，TPL的抗腫瘤作用機制尚不明確，早期的研究認為TPL通過抑制細胞核苷酸轉運體系而抑制DNA、RNA的合成，尤其是對DNA合成的抑制。近年來研究顯示，TPL可以通過多種途徑誘導腫瘤細胞的凋亡，如TPL可以激活凋亡信號傳導的關鍵分子caspase 3及p53，絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases, MAPK)等多種信號通路來誘導腫瘤細胞凋亡[11,14-15]。本研究發現，經TPL作用后，小鼠H22腹水瘤細胞發生了典型的凋亡變化，提示TPL可以誘導H22細胞凋亡，且與對照組比較，經過TPL作用后的小鼠腹水量及腹水瘤細胞數均減少，生存期提高，表明TPL可能通過誘導H22細胞凋亡進而發揮抗腫瘤作用。

PD-L1也稱B7-H1、CD274，是PD-1的配體之一，表達于活化的T細胞、B細胞、NK細胞等。有研究表明，PD-L1在多種人類腫瘤中高表達，如肝癌、卵巢癌、胃癌等。近年來研究表明，負性共刺激分子PD-L1 異常表達可以促使T細胞凋亡，從而抑制機體的免疫功能，使腫瘤細胞發生免疫逃逸，促進了腫瘤細胞的生長。研究表明，沉默PD-L1的表達可以有效誘導A549癌細胞凋亡[16]，提示PD-L1蛋白可能與腫瘤細胞凋亡關系密切。PD-L1在淋巴瘤組織中高表達，并且可以促進腫瘤的生長，并能通過抗凋亡抵制順鉑對腫瘤的殺傷作用[17]。越來越多的證據表明，PD-L1可能成為預測肝癌進展和預后的新分子標志物, 阻斷PD-L1/PD-1信號通路有望成為肝癌免疫治療的新策略。本實驗結果顯示，不同劑量的TPL均可下調PD-L1的表達，且不同程度的誘導腫瘤細胞的凋亡，提示TPL抗肝腹水瘤作用可能與下調腫瘤細胞表面標志蛋白PD-L1有關，二者之間的內在聯系有待進一步深入研究。