Gli抑制劑GANT61對食管腺癌細胞生長和轉移抑制作用的研究

王雷，杜媛鯤，王林，米源，廖海江

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Gli抑制劑GANT61對食管腺癌細胞生長和轉移抑制作用的研究

王雷1，杜媛鯤2，王林1，米源1，廖海江1

目的研究Gli抑制劑GANT61對人食管腺癌細胞OE19和OE33的生長抑制作用及其可能作用機制。方法常規培養OE19和OE33細胞。MTS法檢測不同濃度GANT61（30、20、13.333 3、8.888 8、5.925 9、3.950 6、2.633 7、1.755 8、1.170 5 μmol /L）對OE19和OE33細胞活力的影響，以半數抑制濃度（IC50）表示。OE19和OE33細胞分別設治療組（10 μmol /L GANT61處理）和DMSO組（常規DMSO處理）。實時熒光定量PCR檢測2組OE19和OE33細胞中Gli1和Gli2 mRNA的表達。Western blot法檢測2組OE19和OE33細胞的Gli1、Gli2和CyclinD1蛋白表達量的變化。Transwell侵襲實驗觀察2組OE19和OE33細胞24 h侵襲能力的變化。結果GANT61作用于OE19和OE33細胞72 h的IC50值分別是8.08和9.65 μmol/L。治療組OE19和OE33細胞的Gli1、Gli2 mRNA和蛋白表達水平均低于DMSO組，CyclinD1蛋白表達水平較DMSO組亦顯著降低（P＜0.05）。治療組在OE19和OE33細胞中的穿膜細胞數較DMSO組明顯減少（P＜0.01）。結論GANT61可以通過下調Gli1和Gli2 mRNA及蛋白水平的表達，抑制食管腺癌細胞的生長和侵襲；Hedgehog信號轉導通路異常活化和食管腺癌的發生和發展有關。

食管腫瘤；腺癌；Hedgehog信號通路；Gli；GANT61

食管癌是世界第八大惡性腫瘤，主要包括食管鱗癌和食管腺癌。研究顯示，近年來食管腺癌的發生率和死亡率呈上升趨勢，且傳統的放、化療效果欠佳［1-2］。近年來針對信號傳導通路的靶向治療已經使部分肺腺癌、腸腺癌等腫瘤患者受益［3-4］，但在食管腺癌中仍未找到更佳的治療靶點。大量研究發現，Hedgehog（Hh）信號通路在胃癌［5］、肺癌［6］、成神經管細胞瘤［7］、紅白血病［8］、淋巴瘤［9］等多種腫瘤中異常激活，Hh與腫瘤的發生發展和轉移密切相關。GANT61是近年研制的可特異性針對Hh通路中關鍵靶點Gli的抑制劑，在多種腫瘤中顯示了較好的抗腫瘤活性［10-11］。本研究通過探討GANT61對人食管腺癌細胞系OE19和OE33的Hh通路中Gli1和Gli2表達的影響，觀察GANT61對食管腺癌細胞的增殖及侵襲作用，并初步探討其抗腫瘤作用機制，為食管腺癌的靶向治療提供參考。

1　資料與方法

1.1一般資料人食管腺癌細胞系OE19和OE33購自Sigma-Aldrich公司，RPMI 1640培養液（美國Corning公司），胎牛血清、胰酶（美國Gemini公司），DMSO（美國MPBIO公司），GANT61（美國Selleckchem公司），Gli1、Gli2引物和探針（Hs00171790、Hs01119974_m1，美國Life Technologies公司），Gli1兔抗人多克隆抗體（ab-49314，美國Abcam公司），Gli2鼠抗人單克隆抗體（c-10）、GAPDH鼠抗人單克隆抗體（sc-32233）［美國Santa Cruz公司］，Cyclin D1鼠抗人單克隆抗體（2926S，美國Cell signaling公司），CellTiter-Glo?發光法細胞活力檢測試劑盒、GloMax-96 Microplate Luminometer（美國Promega公司），Pierce-BCA蛋白分析試劑盒、M-PER培養細胞總蛋白提取試劑、NanoDrop 8000全光譜紫外-可見光分光光度計（美國Thermo Scientific公司），蛋白酶抑制劑（德國Roche公司），Mini-PROTEAN TGX預制膠、Tris/甘氨酸/電泳緩沖液、Tris/甘氨酸緩沖液（美國BIO-RAD公司），Transwell膜嵌套、Matrigel膠（美國Corning公司），ABI 7900HT高通量熒光定量PCR儀（美國應用生物系統公司）。

1.2方法

1.2.1細胞培養OE19和OE33細胞于37℃、5%CO2培養箱和RPMI 1640、10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的培養基中培養至對數生長期。

1.2.2 MTS法觀察GANT61對細胞活力的影響將呈對數生長期的OE19和OE33細胞用0.25%胰酶消化、離心、細胞計數后用無血清培養基懸浮細胞，按照5 000個/孔細胞密度接種于96孔細胞培養板中，每孔50 μL培養液，每個濃度設3個復孔，并設常規DMSO處理為對照組。于37℃、5%CO2培養箱內培養過夜，次日每孔加入50 μL無血清培養基稀釋的不同終濃度GANT61（30、20、13.333 3、8.888 8、5.925 9、3.950 6、2.633 7、1.755 8、1.170 5 μmol/L）繼續培養72 h后室溫放置96孔板10 min，每孔加入CellTiter-Glo?發光法細胞活力檢測試劑100 μL，10 min后將96孔板置于GloMax-96 Microplate Luminometer儀器，采用儀器中CellTiter-Glo?軟件讀取數據，將所得數據應用Graphpad Prism 6軟件進行數據分析。計算GANT61對OE19和OE33細胞的半數抑制濃度（IC50），實驗重復3遍。

1.2.3實時熒光定量（RT）-PCR法檢測GANT61對OE19、OE33細胞Gli1、Gli2 mRNA表達量的影響分別將OE19 和OE33細胞于每孔1×105個接種到12孔板，次日細胞呈70%～80%融合生長時更換無血清培養基，并加入10 μmol /L的GANT61（治療組），設DMSO組為對照，培養24 h后用PBS洗滌細胞3次，按照總RNA提取試劑盒說明書提取RNA，應用NanoDrop 8000全光譜紫外-可見光分光光度計檢測樣本RNA濃度，參照美國BIO-RAD公司的反轉錄cDNA合成試劑盒說明書應用Thermal Cycler儀器進行cDNA的反轉錄。反轉錄條件：25℃5 min，42℃30 min和85℃5 min。用無R-Nase水稀釋cDNA 10倍，取4.5 μL作為模板，隨后分別加入Gli1、Gli2和GAPDH（內參）基因的引物及探針（0.5 μL）以及Taqman基因表達預混液5 μL，以10 μL/孔加樣在384孔板上于ABI 7900HT高通量熒光定量PCR儀中進行PCR檢測，PCR反應條件：預變性95℃5 min；95℃10 s，60℃10 s，72℃10 s，共40個循環。讀取Ct值后采用2- Ct法進行數據分析。

1.2.4 Western blot法檢測不同處理對OE19和OE33細胞中Gli1、Gli2和CyclinD1蛋白表達量的影響分別將OE19 和OE33細胞以每孔3×105個接種到6孔板，次日待細胞呈70%～80%融合生長時更換無血清培養基，并每孔加入10 μmol /L的GANT61（治療組），設DMSO組為對照。繼續培養24 h后用PBS洗滌細胞3次，加入M-PER培養細胞總蛋白提取試劑和蛋白酶抑制劑，收集蛋白提取液并測定蛋白濃度。在Mini-PROTEAN TGX預制膠的每個泳道行總蛋白上樣10 μg，經Tris/甘氨酸/電泳緩沖液SDS進行電泳，電泳條件200 V 40 min。在Tris-甘氨酸緩沖液中將蛋白電轉移印跡到PVDF膜，反應條件100 V 40 min。5%脫脂奶粉/TBST液封閉PVDF膜1 h后，孵育一抗4℃過夜。Gli1一抗濃度為1：1 000，Gli2一抗濃度為1：250，CyclinD1一抗濃度為1：1 000，內參GAPDH一抗濃度為1：10 000。次日TBST洗膜3次，每次10 min后室溫孵育二抗1 h，二抗濃度均為1：20 000，再用TBST洗膜3次，每次10 min，ECL試劑發光后于暗室曝光，顯影。應用Image軟件對顯影的蛋白質條帶進行灰度值分析，以目的蛋白條帶與GAPDH（內參蛋白）條帶的灰度值之比表示目的蛋白的相對表達水平。

1.2.5 Transwell侵襲實驗檢測不同處理對OE19和OE33細胞侵襲能力的影響用培養基與Matrigel膠按照4：1稀釋后包被Transwell小室基底膜，放置培養箱內2 h待Matrigel膠凝固。分別以10 μmol/L GANT61（治療組）、常規DMSO處理（DMSO組）OE19和OE33細胞，每孔以7.5×104個接種于上室，上室內加無血清培養基，下室加含10%胎牛血清培養液。培養箱內繼續培養24 h后吸去上室培養基，用棉簽擦除Matrigel膠，70%乙醇固定，0.1%結晶紫染色，在高倍鏡下（×400）每張膜取4個視野計數穿膜細胞數，計算平均值。

1.3統計學方法采用SPSS 17.0統計軟件進行數據處理。符合正態分布的計量資料以x ±s表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1不同濃度GANT61藥物對OE19和OE33細胞活力的影響GANT61作用于OE19和OE33細胞72 h 的IC50值分別是8.08 μmol/L和9.65 μmol/L，見圖1。

2.2 2組OE19和OE33細胞中Gli1、Gli2 mRNA表達水平比較治療組OE19和OE33細胞的Gli1、Gli2 mRNA的表達水平均低于DMSO組（P＜0.05），見表1。

Tab. 1 The expression levels of Gli1，Gli2 mRNAs in OE19 and OE33 cells treated with GANT61表1　GANT61對OE19、OE33細胞Gli1、Gli2 mRNA表達的影響　（n=3，2- Ct，x ±s）

2.3 2組OE19和OE33細胞Gli1、Gli2和CyclinD1蛋白表達水平比較OE19和OE33細胞的Gli1、Gli2和CyclinD1蛋白表達水平較DMSO組均顯著降低（P＜0.05），見圖2、表2。

Fig. 2 The expression levels of Gli1，Gli2 and CyclinD1 proteins in OE19 and OE33 cells treated with GANT61圖2　GANT61對OE19和OE33細胞中Gli1、Gli2、和CyclinD1蛋白表達的影響

Tab. 2 Comparison of Gli1，Gli2 and CyclinD1 expression levels treated with GANT61 or DMSO in OE19 and OE33 cells表2　2組OE19和OE33細胞中Gli1、Gli2、CyclinD1表達水平比較　（n=3，x ±s）

2.4不同處理對OE19和OE33細胞侵襲能力的影響OE19治療組穿膜細胞數（55.33±5.03）較DMSO組（114.67±53.00）、OE33治療組（72.67±5.50）較DMSO組（137.33±7.50）均明顯減少（t分別為14.988 和12.031，P＜0.01），見圖3。

Fig.3 The effects of GANT61 on invasion ability of OE19和OE33 cells（crystal violet staining，×400）圖3　GANT61對OE19和OE33細胞侵襲能力的影響（結晶紫染色，×400）

3　討論

經典的Hh信號傳導通路主要包括Hh配體、Ptch受體、Smo蛋白和Gli轉錄因子等。當Hh配體異常表達或者Smo蛋白被過度活化時，可導致核轉錄因子Gli異常活化，活化的Gli進入細胞核內轉錄激活子，啟動Hh通路下游靶基因的轉錄，從而對腫瘤的增殖分化、血管新生、侵襲轉移及細胞凋亡發揮關鍵作用。Hh通路抑制劑GDC-0449主要是針對Hh上游靶點Smo，具有一定抗腫瘤效果，其中GDC-0449已被美國FDA批準用于臨床試驗治療基底細胞癌［12-13］，但由于Smo存在天然或獲得性突變以及多條信號通路之間的交叉調控，導致針對Hh上游通路的靶向治療效果并不理想。

Gli家族包括Gli1、Gli2和Gli3，其中Gli1和Gli2發揮激活劑的功能，因為Gli作為轉錄作用因子在Hh信號通路中起著承上啟下的作用，所以將Gli作為靶點對Hh信號通路進行調控可以起到更好的作用。Li等［14］應用針對Gli和Smo靶點的siRNA和小分子抑制劑對惡性間皮瘤進行體內外抑瘤實驗顯示，Gli抑制劑比針對Smo靶點的siRNA和小分子抑制劑具有更強的抗腫瘤作用，能顯著抑制腫瘤細胞的生長和轉移，Gli有望成為更有效的抗腫瘤靶點。因此，本研究采用GANT61選擇性抑制Hh通路的靶點，探討Gli和食管腺癌細胞生長和轉移的關系。

CyclinD1是一種原癌基因，在膀胱癌［15］，卵巢癌［16］等多種腫瘤中擴增或者過度表達，可導致細胞增殖失控并產生惡變，并且與預后相關。本研究結果顯示，GANT61作用于OE19和OE33細胞72 h的IC50值分別是8.08 μmol/L和9.65 μmol/L，GANT61治療組OE19和OE33細胞的Gli1、Gli2 mRNA的表達水平均低于DMSO組，Gli1、Gli2和CyclinD1蛋白表達水平較DMSO組均顯著降低，表明GANT61可以顯著抑制食管腺癌細胞活力，并且顯著抑制食管腺癌細胞OE19和OE33中的Gli1和Gli2 mRNA和蛋白表達，下調CyclinD1蛋白表達，提示活化的Hh/Gli通路可以通過上調其下游靶基因CyclinD1的表達來促進細胞異常增殖，而GANT61可以特異性抑制Gli1和Gli2的表達，從而下調CyclinD1的表達，進而影響細胞周期，實現抑制腫瘤細胞生長增殖的作用。Srivastava等［17］研究顯示，GANT61可以通過顯著下調橫紋肌肉瘤細胞中CyclinD1/2/3 和CyclinE的表達，從而抑制細胞增殖。本研究結果與此基本一致。此外，有研究表明，Gli可以增強腫瘤細胞的運動能力和侵襲性，促進腫瘤細胞的上皮間質轉化，從而提高腫瘤的侵襲能力［18］。本研究Transwell侵襲實驗結果顯示，GANT61治療組的OE19和OE33穿膜細胞數較DMSO組均明顯減少，表明GANT61可使食管腺癌細胞的侵襲能力顯著下降，考慮機制可能與GANT61通過抑制Gli的表達，從而下調腫瘤細胞的上皮間質轉化能力有關。

綜上所述，鑒于Gli在食管腫瘤生長和轉移中的關鍵作用以及GANT61良好的抗腫瘤活性，GANT61有望成為有效的抗食管癌靶向藥物。

（圖3見插頁）

［1］Fan YJ，Song X，Li JL，et al. Esophageal and gastric cardiacancers on 4238 Chinese patients residing in municipal and rural regions：a histopathological comparison during 24-year period［J］. World J Surg，2008，32（9）：1980-1988. doi：10.1007/s00268-008-9674-x.

［2］Borghesi S，Hawkins MA，Tait D. Oesophagectomy after definitive chemoradiation in patients with locally advanced oesophageal cancer［J］. Clin Oncol（R Coll Radiol），2008，20（3）：221-226. doi：10.1016/j.clon.2007.12.001.

［3］Lin JJ，Cardarella S，Lydon CA，et al. Five-year survival in EGFR-mutant metastatic lung adenocarcinoma treated with EGFR-TKIs［J］. JThorac Oncol，2015 Dec 25. doi：10.1016/j.jtho.2015.12.103.［Epub ahead of print］

［4］Artemov A，Aliper A，Korzinkin M，et al. A method for predicting target drug efficiency in cancer based on the analysis of signaling pathway activation［J］. Oncotarget，2015，6（30）：29347-29356. doi： 10.18632/oncotarget.5119.

［5］Seto M，Ohta M，Asaoka Y，et al. Regulation of the hedgehog signaling by the mitogen-activated protein kinase cascade in gastric cancer［J］. Mol Carcinog，2009，48（8）：703- 712. doi：10.1002/ mc.20516.

［6］Bermudez O，Hennen E，Koch I，et al. Gli1 mediates lung cancer cell proliferation and Sonic Hedgehog- dependent mesenchymal cell activation［J］. PLoS One，2013，8（5）：e63226. doi：10.1371/ journal.pone.0063226.

［7］Archer TC，Weeraratne SD，Pomeroy SL. Hedgehog-GLI pathway in medulloblastoma［J］. J Clin Oncol，2012，30（17）：2154-2156. doi：10.1200/JCO.2011.41.1181.

［8］Ghezali L，Liagre B，Limami Y，et al. Sonic Hedgehog activation is implicated in diosgenin-induced megakaryocytic differentiation of human erythroleukemia cells［J］. PLoS One，2014，9（4）：e95016. doi：10.1371/journal.pone.0095016. eCollection 2014.

［9］Kern D，Regl G，Hofbauer SW，et al. Hedgehog/GLI and PI3K signaling in the initiation and maintenance of chronic lymphocytic leukemia［J］. Oncogene，2015，34（42）：5341-5351. doi：10.1038/onc.2014.450.

［10］Chen Q，Xu R，Zeng C，et al. Down-regulation of Gli transcription factor leads to the inhibition of migration and invasion of ovarian cancer cells viaintegrin beta4-mediated FAK signaling［J］. PLoS One，2014，9（2）：e88386. doi：10.1371/journal.pone.0088386. eCollection 2014.

［11］Hassounah NB，Bunch TA，McDermott KM. Molecular pathways：the role of primary cilia in cancer progression and therapeutics with a focus on Hedgehog signaling［J］. Clin Cancer Res，2012，18（9）：2429-2435. doi：10.1158/1078-0432.CCR-11-0755.

［12］LoRusso PM，Rudin CM，Reddy JC，et al. Phase I trial of hedgehog pathway inhibitor vismodegib（GDC-0449）in patients with refractory，locally advanced or metastatic solid tumors［J］. Clin Cancer Res，2011，17（8）：2502-2511. doi：10.1158/1078-0432.CCR-10-2745.

［13］Sekulic A，Migden MR，Oro AE，et al. Efficacy and safety of vismodegib in advanced basal-cell carcinoma［J］. N Engl J Med，2012，366（23）：2171-2179. doi：10.1056/NEJMoa1113713.

［14］Li H，Lui N，Cheng T，et al. Gli as a novel therapeutic target in malignant pleural mesothelioma［J］. PLoS One，2013，8（3）：e57346. doi：10.1371/journal.pone.0057346.

［15］Seiler R，Thalmann GN，Rotzer D，et al. CCND1/CyclinD1 status in metastasizing bladder cancer：a prognosticator and predictor of chemotherapeutic response［J］. Mod Pathol，2014，27（1）：87-95. doi：10.1038/modpathol.2013.125.

［16］Wang H，Wang H，Makki MS，et al. Overexpression of betacatenin and cyclinD1 predicts a poor prognosis in ovarian serous carcinomas［J］. Int JClin Exp Pathol，2014，7（1）：264-271.

［17］Srivastava RK，Kaylani SZ，Edrees N，et al. GLI inhibitor GANT-61 diminishes embryonal and alveolar rhabdomyosarcoma growth by inhibiting Shh/AKT-mTOR axis［J］. Oncotarget，2014，5（23）：12151-12165. doi：10.18632/oncotarget.2569.

［18］Chen JS，Li HS，Huang JQ，et al. Down-regulation of Gli1 inhibits hepatocellular carcinoma cell migration and invasion［J］. Mol Cell Biochem，2014，393（1/2）：283- 291. doi：10.1007/s11010- 014-2071-x.

（2015-11-25收稿2016-01-18修回）（本文編輯陸榮展）

GANT61 as an inhibitor of Gli inhibits growth and invasion of esophageal adenocarcinoma

WANG Lei1，DU Yuankun2，WANG Lin1，MI Yuan1，LIAO Haijiang1
1 Department of Thoracic Surgery，the Fourth Hospital of Hebei Medical University，Hebei Shijiazhuang 050011，China；2 Department of Journal，Hebei Medical University

Objective To study the inhibitory effects of GANT61，as an inhibitor of Gli，on the growth of human esophageal adenocarcinoma cell lines OE19 and OE33，and their mechanisms thereof. Methods After treating with different concentrations of GANT61（30，20，13.333 3，8.888 8，5.925 9，3.950 6，2.633 7，1.755 8，1.170 5 μmol/L），the cell viabilities of OE19 and OE33 were detected by MTS method，which expressed by IC50. The Gli1and Gli2 mRNA expressions treated with GANT61（10 μmol/L GANT61）or DMSO for 24 h were detected in OE19 and OE33 cell lines by real time fluorescence quantitative PCR. The protein expressions of Gli1，Gli2 and CyclinD1 treated with GANT61 or DMSO for 24 h were detected in OE19 and OE33 cell lines by Western blot assay. Transwell invasion assay was performed to evaluate the inhibiting effect on OE19 and OE33 cell invasion by the treatment of GANT61 or DMSO. Results The IC50of GANT61 was 8.08 μmol/L in OE19 and 9.65 μmol/L in OE33 cells. Compared with DMSO group，Gli1 and Gli2 mRNA expressions and Gli1，Gli2 and CyclinD1 protein expressions were significantly decreased in OE19 and OE33 cells of GANT61 group（P＜0.05）. The number of penetrating cells was significantly reduced in OE19 and OE33 cells of GANT61 group compared with that of DMSO group（P＜0.01）. Conclusion GANT61 can inhibit the growth and invasion of esophageal neoplasms cells by down-regulating Gli1 and Gli2 mRNA expression，which indicates that Hedgehog signaling pathway may play an important role in carcinogenesis and progression of esophageal adenocarcinoma．

esophageal neoplasms；adenocarcinoma；hedgehogsignal transduction pathway；Gli；GANT61

R655.3

A

10.11958/20150351

河北省科技廳科技攻關課題資助（132077127D）

1河北石家莊，河北醫科大學第四醫院胸二科（郵編050011）；2河北醫科大學期刊社

王雷（1976），男，副教授，醫學博士后，主要從事胸部腫瘤的靶向治療