高通量測序技術分析醬香型白酒下造沙輪次的微生物多樣性

呂錫斌，吳耀領，郝 飛，曾祥煉，張巧玲，陳良強，袁 頡，羅汝葉，楊 帆，王和玉，王 莉，尉洪濤，韓培杰，白逢彥

(1.貴州茅臺酒股份有限公司技術中心，貴州 仁懷 564501；2.中國科學院微生物研究所，真菌學國家重點實驗室，北京 100101)

中國白酒是世界上最古老的蒸餾酒之一，在中國文化和人民日常生活中發揮著重要作用[1]。醬香型白酒作為中國基本香型之一的白酒，其獨特的傳統釀造工藝使得釀造體系中形成了復雜的微生物群落結構，使其具有醬香突出、幽雅細膩、酒體醇厚、回味悠長、空杯留香持久等特點。因此，研究醬香型白酒釀造過程微生物群落結構，對解析醬香型白酒釀造機理、提高醬香型白酒產量及質量具有重大意義。

醬香型白酒釀造的工藝特點為：兩次投料“下沙、造沙”、八次堆積發酵、九次蒸餾、七次取酒，最終由不同風格特點的輪次酒長期貯存，精心勾兌醞釀出高品質的醬香白酒。下沙、造沙輪次是醬香型白酒釀造的基礎輪次，其工藝操作關系到后期輪次發酵過程中微生物的生長繁殖[2]，同時下沙、造沙輪次酒醅中可累積更多的微生物代謝產物及產酒輪次所需醬香型白酒前體物質，有利于后期輪次基酒香味物質的形成[3-4]。因此了解和掌握下沙、造沙酒醅微生物的多樣性及其菌群變化，對揭示醬香型白酒獨特的香味物質的形成機理，對保障后期輪次物料供給平衡和微生物代謝平衡，對醬香型白酒生產都至關重要，而目前對此的研究普遍較少。

本研究旨在通過Illumina Miseq PE300高通量測序平臺測序研究分析醬香型白酒下沙、造沙輪次發酵過程細菌16S rRNA和真菌ITS高變區，研究堆積、窖內發酵酒醅中的微生物多樣性及其主要功能群落結構，深入認識發酵過程的微生物多樣性，解析制酒過程中細菌、真菌的組成、變化及其演替規律。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒醅：取自貴州茅臺酒股份有限公司制酒車間。

菌種：細菌、真菌培養基購于國藥集團化學試劑北京有限公司。

耗材及試劑：菌株DNA提取、16S rDNA片段和真菌ITS擴增所用的酶、Marker、dNTPs、Buffer等購于生工生物上海股份有限公司；其余試劑均為國產分析純。

儀器設備：Illumina Miseq PE300高通量測序平臺測序；Vortex振蕩器，德國IKA公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 取樣方法

每個輪次醬香型白酒生產分為堆積發酵和窖內發酵兩個階段。如圖1所示，在堆積發酵階段0 d、1 d、2 d、3 d酒醅樣品在堆積表面約20 cm深的D點取樣。入窖時，對A、B、C、D和E點的5個酒醅樣品進行收集。在窖內發酵過程中，對距離窖池邊緣約30 cm，深度約120 cm的D點酒醅樣品在發酵0 d、3 d、6 d、12 d、21 d、30 d以及出窖時進行收集，用于細菌和真菌的高通量測序。

圖1 取樣點圖示

1.2.2 高通量測序分析方法

總體基因組DNA直接從樣本中提取[5]，利用Illumina Miseq PE300高通量測序平臺測序。細菌的16S rRNAV3—V4擴增引物為338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和 806R（5'-GGACTACNNGGG TATCTAAT-3'），真 菌 擴 增 引 物 為ITS3（5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）。PCR反應體系：12.5 μL 2× Taq PCR MasterMix，3 μL BSA(2 ng/μL)，2 Primer(5 μM)，2 μL 模板 DNA,和5.5μL ddH2O。反應參數：95℃預變性5 min；95 ℃ 變性45 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸45 s，32個循環；72℃延伸10 min終止。擴增序列通過Illumina MiSeq平臺進行Paired-end測序，下機數據經過QIIME（v1.8.0）軟件過濾、拼接、去除嵌合體，去除得分低于20分、堿基模糊、引物錯配或測序長度小于150 bp的序列。

經過上述步驟后，將標簽分組具有97%序列相似性的高質量的OTU序列[6-8]，細菌得到的每個OTU代表序列比對silva數據庫和NT數據庫，真菌得到的OTU代表序列比對UNITE數據庫和NT數據。最后再通過人工進行檢查以獲得物種信息。稀疏曲線使用R語言繪制來評估微生物多樣性。

2 結果與分析

2.1 Alpha多樣性分析

計算下沙（XS）、造沙（ZS）輪次Chao1指數以確定物種豐富度，Shannon指數以確定物種多樣性，pielou指數反映微生物個體數目分配的均勻程度，以描述堆積、窖內發酵酒醅樣品中細菌、真菌群落的多樣性。

2.1.1 稀疏曲線分析（圖2）

由圖2可知，下沙、造沙輪次的樣品細菌、真菌稀疏曲線都趨向平坦，說明各樣本細菌、真菌的測序數據量合理，測序深度已足夠。

2.1.2 Shannon指數、Pielou指數分析（表1）

由表1可看出，下沙、造沙堆積發酵細菌及下沙堆積發酵真菌Shannon指數、pielou指數均高于窖內發酵，說明堆積樣品中微生物的多樣性及物種均勻程度高于窖內發酵，造沙窖內發酵真菌則反之。也說明了同輪次不同發酵階段及不同輪次間的微生物多樣性存在一定差異。

注：XS：下沙；ZS：造沙；stack：堆積；pit：窖內。

表1 不同發酵過程中酒醅樣品Shannon指數及Pielou指數

2.2 不同發酵時期微生物群落多樣性結構分析

2.2.1 下沙、造沙輪次細菌分類

對下沙（XS）、造沙（ZS）輪次發酵過程中酒醅樣品細菌群落結構在屬分類水平上的結果進行對比（相對豐度＜0.1%及未鑒定出的種類歸入“其他”），結果見表2。

表2 下沙、造沙發酵過程中酒醅主要細菌群類占比

對酒醅樣品中細菌群落的高通量測序結果進行分析，結果發現：下沙、造沙輪次分別檢測到203個、184個細菌屬。在下沙輪次發酵過程中乳酸菌為豐度最高的細菌，其中Lactobacillus(50.80%)、Weissella(25.08%)、Pediococcus(17.94%)、Lentibacillus(0.92%)、Kroppenstedtia(0.91%)為下沙輪次主要細菌屬；造沙輪次發酵過程中乳酸菌同為豐度最高的細菌屬，其中Lactobacillus(78.08%)、Pediococcus(6.57%)、Acetobacter(5.91%)、Lentibacillus(2.23%)、Bacillus(2.06%)、Kroppenstedtia(1.52%)、Oceanobacillus（1.42%）為造沙輪次主要細菌屬。

2.2.2 下沙、造沙輪次真菌分類（表3）

表3 下沙、造沙發酵過程中酒醅主要真菌群類占比(%)

下沙、造沙輪次分別檢測到160個、109個真菌屬。在下沙輪次發酵過程中畢赤酵母屬為豐度最高的真菌，其中Pichia(84.78%)、Saccharomyces(6.23%)、Thermoascus(1.95%)、Aspergillus(1.45%)、Monascus(0.8%)為下沙輪次主要真菌屬；造沙輪次主要真菌屬為Pichia(77.71%)、Saccharomyces(13.80%)、Thermoascus(2.65%)、Thermomyces(1.0%)、Aspergillus(0.67%)。

2.3 細菌、真菌的演替規律

2.3.1 下沙、造沙輪次發酵過程中細菌群落的演替規律分析（圖3、圖4）

圖3 下沙發酵過程中細菌群落結構變化

圖4 造沙發酵過程中細菌群落結構變化

下沙輪次堆積開始時，酒醅通過網羅大曲和環境獲得了豐富的微生物資源，其中Pediococcus acidilactici（27.82%）、Lentibacillus sp.（14.38%）、Thermoactinomyces sanguinis（11.11%）為優勢菌，同時還有其他細菌種屬，如Weissella paramesenteroides（9.02%）、Oceanobacillus sp.（7.63%）、Bacillus amyloliquefaciens（7.53%）、Oceanobacillus indicireducens（3.41%）、Staphylococcus condimenti（3.33%）、Bacillus sp.（3.09%）、Kroppenstedtia eburnea（2.9%）、Lactobacillus plantarum（1.16%）等。經高溫堆積發酵至發酵結束，不同取樣位置、堆積時間的微生物相對豐度略有波動，優勢菌主要為Weissella paramesenteroides、Pediococcus acidilactici、Lactobacillus plantarum等乳酸菌，且相對豐度為80%以上。

在窖內發酵初期，細菌群落結構與堆積后期相近，至窖內發酵7 d，菌群結構發生較大變化，Lactobacillus panis相對豐度增至76.21%，占絕對優勢地位。窖內發酵結束，Lactobacillus panis豐度回落至51.92%，與Lactobacillus acetotolerans（34.66%）同為優勢菌，同時有Pediococcus acidilactici（3.31%）、Lactobacillus plantarum（3.02%）、Lactobacillus pontis（1.93%）、Lactobacillus buchneri（1.47%）等均為乳酸菌。

造沙堆積開始時，Lentibacillus sp.（22.57%）、Bacillus amyloliquefaciens（14.72%）、Pediococcus acidilactici（10.94%）、Oceanobacillus sp.（10.01%）為優勢菌，同時還有Thermoactinomyces sanguinis（9.23%）、Oceanobacillus indicireducens（4.15%）、Staphylococcus condimenti（3.02%）、Kroppenstedtia eburnea（3.0%）、Lactobacillus panis（2.22%）、Bacillus kokeshiiformis（2.06%）、Acetobacter ghanensis（1.91%）等。經高溫堆積至發酵結束，優勢菌主要為Lactobacillus panis、Pediococcus acidilactici、Acetobacter ghanensis，均為產酸微生物，且相對豐度為90%以上。

窖內發酵的細菌群落結構變化較大，發酵初期Lactobacillus panis相對豐度為76.22%，為絕對優勢菌，窖內厭氧發酵過程中Lactobacillus panis、Lactobacillus sp.、Lactobacillus acetotlerans呈現升高后降低的趨勢，至窖內發酵結束，Lactobacillus sp.（78.62%）、Lactobacillus acetotolerans（16.07%）、Lactobacillus panis（3.86%），乳酸菌成為優勢菌，相對豐度為98%以上。

2.3.2 下沙、造沙輪次發酵過程中真菌群落的演替規律分析（圖5、圖6）

圖5 下沙發酵過程中真菌群落結構變化

下沙輪次真菌微生物多樣性比較單一，從下沙堆積至窖內發酵結束，Pichia kudriavzevii是絕對優勢菌株。堆積0 d至堆積發酵結束，Pichia kudriavzevii相對豐度由41.28%升至91.28%，Saccharo-myces cerevisiae則先升后降至1.63%。窖內發酵階段真菌群落結構變化不大，到發酵結束，Pichia kudriavzevii（89.56%）、Pichia manshurica（7.74%）為優勢菌，Saccharomyces cerevisiae降至1.35%。

圖6 造沙發酵過程中真菌群落結構變化

造沙輪次發酵過程中Pichia kudriavzevii在窖內發酵結束降至48.78%，Saccharomyces cerevisiae先升后降至22.32%，Pichia manshurica則升高至14.67%。但整體與下沙輪次發酵過程相比，Pichia kudriavzevii相對豐度下降明顯，Saccharomyces cerevisiae與Pichia manshurica均有較大幅度增長。

2.4 不同輪次不同發酵階段主成分分析（Principal component analysis）（圖7、圖8）

圖7 不同發酵階段細菌主成分分析

通過主成分分析，將多維變量降維成兩個變量進行分析，細菌群落第一主成分（PC1）貢獻率達46.1%，第二主成分（PC2）貢獻率達27.7%；真菌群落第一主成分（PC1）貢獻率達93.1%，第二主成分（PC2）貢獻率達4.4%。結果顯示，下沙堆積、窖內及造沙堆積、窖內各自聚為一類，說明不同輪次不同發酵階段菌群結構及微生物多樣性存在顯著差異（p＜0.05）。

圖8 不同發酵階段真菌主成分分析

3 結論

本研究基于醬香型白酒下沙、造沙輪次酒醅高通量測序結果對其堆積發酵及窖內發酵過程中的細菌、真菌多樣性進行了分析。

下沙、造沙分別檢測到細菌203個屬和184個屬，乳酸菌為優勢細菌貫穿了下沙、造沙堆積發酵，窖內發酵的整個過程，說明了乳酸菌對醬香型白酒發酵的重要性。在堆積發酵結束，Weissella paramesenteroides、Pediococcus acidilactici、Lactobacillus panis占比可達80%以上，窖內發酵結束，Lactobacillus panis、Lactobacillus sp.、Lactobacillus acetotolerans占比可達90%以上。而清香型白酒發酵過程中優勢乳酸菌比較單一，Lactobacillus fuchuensis相對豐度始終保持在較高的水平[9]；濃香型白酒發酵過程中占絕對優勢地位的是Lactobacillus acetotolerans，其在發酵3 d后相對豐度可占整個乳酸菌屬98%以上，并持續至發酵結束[10-12]。

下沙、造沙分別檢測到真菌160個屬和109個屬，優勢菌屬均為酵母菌，下沙期間，Pichia kudriavzevii為絕對優勢菌，占比在90%左右，造沙窖內發酵時，Saccharomyce scerevisiae大量繁殖，至窖內發酵結束達到22.32%，Pichia kudriavzevii占比仍達48.78%。下沙、造沙輪次是醬香型白酒的非產酒輪次，酵母菌作用則主要表征在產香及產前體物質方面[13-15]。Saccharomyces cerevisiae是白酒發酵過程中的主要產酒微生物，在不同香型的發酵過程中都不可或缺[16-17]，但其在醬香型白酒造沙窖內發酵期間才大量生長，占比可達20%～40%之間。Pichia kudriavzevii、Pichia membranifaciens、Candida krusei、Zygosaccharomyces bailii等均對酸、醇具有較強酯化能力，產生的物質對酒體風格形成具有重要作用[16，19-23]，其中Pichia kudriavzevii在不同香型白酒發酵過程中的演替規律存在顯著差異，在醬香型白酒發酵過程中其相對豐度最高可達95%以上，清香型白酒發酵起始時，Pichia kudriavzevii相對豐度最大(85.12%)，到發酵20 d豐度降至最小(32.85%)，至發酵結束升至43.29%[18]；濃香型白酒占主體地位的主要為Saccharomyces cerevisiae[24-25]。

由此可見，白酒發酵過程中主要微生物菌群結構的差異是造成不同香型白酒差異明顯的因素之一，也是醬香型白酒不同輪次間白酒香氣成分差異的主要因素。但是目前仍不清楚不同乳酸菌、酵母菌間相互作用對于白酒釀造過程的影響，且醬香型白酒發酵過程中溫度、酒醅糊化程度、水分、淀粉、酸度、微生物間相互作用等的變化均為影響微生物生長代謝的環境因素，從而形成不同發酵階段微生物多樣性的差異。因此，后續將在下沙、造沙輪次微生物多樣性和演替規律的基礎上，進一步結合可培養實驗對發酵過程中微生物的功能及相互作用進行研究，為更好地揭示醬香型白酒釀造機理和控制白酒品質提供生物學依據。