有氧運動對腦小血管病大鼠執(zhí)行功能的效果

王茹，劉楠，李衛(wèi)萍，趙弘軼，杜菊梅，黃勇華

1.中國人民解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學中心神經內科，北京市100700；2.陜西中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，陜西咸陽市712000

腦小血管病(cerebral small vessel disease,CSⅤD)作為一種日益增長的醫(yī)學和社會經濟負擔而受到關注。它能夠引起全世界約1/5的腦卒中[1]，是老年人致殘和致死的重要原因[2]。進行性的認知執(zhí)行功能下降與老年人群中近一半的癡呆相關[3]。CSⅤD引起認知功能障礙主要表現為執(zhí)行功能下降，早期診斷及有效干預能夠防治CSⅤD相關的認知障礙[4]。越來越多的證據表明，體育鍛煉對多個認知領域有益，特別是執(zhí)行功能[5]；此外，運動還可以減緩正常老化中的認知功能下降和神經變性[6]。

腦源性神經營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)是一種對腦和周圍組織發(fā)揮多種效應的蛋白質[7]，在神經元生長、分化、再生和凋亡中發(fā)揮重要作用[8]。在神經發(fā)生過程中，BDNF通過激活下游原肌球蛋白受體激酶B(tropomyosin receptor kinase B,TrkB)促進神經干細胞生長[9]，并具有調節(jié)突觸的作用[10]。BDNF在神經元細胞的樹突生長和形態(tài)學方面也發(fā)揮重要作用[11]。

有氧運動可增加大鼠和小鼠齒狀回的神經發(fā)生[12]；限制大鼠運動可損害神經發(fā)生，并降低BDNF水平[13]。運動可恢復小鼠海馬受損的神經發(fā)生水平，并且與BDNF表達增強相關[14]。BDNF參與有氧運動誘導的神經發(fā)生和神經傳導，可以調節(jié)動物和人類認知，在神經可塑性方面也起重要作用[15]。

本研究探討有氧運動對CSⅤD大鼠BDNF/TrkB信號通路的影響，以及海馬神經元增殖分化和執(zhí)行功能。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8周齡健康雄性Sprague-Dawley大鼠48只，體質量(350±12.8)g，購自北京斯貝福實驗動物科技有限公司，動物許可證號SCXK(京)2016-0002。飼養(yǎng)室溫度20～25℃，相對濕度50%～65%，環(huán)境保持相對安靜，12 h光照黑暗交替，自由攝取食水。

本研究由陸軍總醫(yī)院動物管理和使用委員會批準，并嚴格按照國際實驗動物福利和動物倫理學要求進行實驗。

1.2 實驗儀器和試劑

冰凍切片機：德國LEⅠCA公司。熒光顯微鏡：日本奧林巴斯公司。兔抗BDNF抗體(批號ab108319)、兔抗TrkB抗體(批號ab187041)、兔抗Neun抗體(批號ab177487)、兔抗Ki67抗體(批號ab15580)：英國ABCAM公司。小鼠抗雙皮質素(doublecortin,DCX)抗體(批號SC-271390)：美國SANTA CRUZ公司。高爾基染色液(批號G1069)、兔抗GAPDH抗體(批號GB11002)：武漢賽維爾生物科技有限公司。辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔ⅠgG二抗(批號M21002)：艾比瑪特生物醫(yī)藥(上海)有限公司。Alexa Fluor488標記的山羊抗兔ⅠgG二抗(批號A0423)、Alexa Fluor555標記的驢抗小鼠ⅠgG二抗(批號A0460)：上海碧云天公司。

1.3 方法

1.3.1 模型建立及分組

采用雙側頸動脈結扎法(bilateral common carotid artery occlusion,BCCAO)制備大鼠CSⅤD模型[16]。實驗大鼠編號，隨機數字表法將大鼠分為假手術組、模型組和游泳組，每組16只。大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，模型組和游泳組以10%水合氯醛4 ml/kg腹腔注射麻醉。大鼠仰臥位，頸正中切口約2 cm，仔細分離左側頸總動脈，避免損傷神經肌肉，手術縫線結扎，關閉切口。待大鼠蘇醒后回籠飼養(yǎng)。1周后相同方法結扎右側頸總動脈。

術后4周，行挖穴試驗評定，如與假手術組相比挖穴能力有顯著性差異，提示造模成功。

假手術組大鼠僅分離雙側頸動脈，不結扎。

1.3.2 訓練方案

游泳組大鼠于造模成功后游泳訓練4周。游泳池為圓形罐，直徑80 cm，高90 cm，水深60 cm，水溫32～35℃。采用低強度游泳訓練[17-18]，每天游泳時間共2 h，分兩次，之間休息15 min。第1周訓練3 d，以后每周增加1 d，共4周。

1.3.3 挖穴試驗

BCCAO術后4周行挖穴試驗，評定造模是否成功；并在每周游泳后行挖穴試驗。塑料水管直徑10 cm，長32 cm，填充沙礫2500 g。管的一端抬離地面6 cm。固定于16:00開始測試，2 h后稱量管內剩余的沙礫質量作為基線，剩余沙礫用于挖穴能力測定。次日8:00再次稱量剩余沙礫質量。評定標準參照Deacon[19]的研究。

1.3.4 Western blotting

挖穴試驗測試完畢后，每組取5只大鼠，斷頭取腦，冰上快速分離海馬組織，稱取50 mg，加入含PMSF的PⅠPA裂解液(1∶500)300 ml中勻漿，4℃、12,000 r/min離心5 min，取上清；加4×蛋白上樣緩沖液，BCA試劑盒測定蛋白濃度；SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜；10%脫脂奶粉封閉2 h，分別加兔抗BDNF一抗(1∶1000)和兔抗TrkB一抗(1∶5000)，4℃過夜。TBST洗滌3次，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔ⅠgG二抗(1∶6000)室溫2 h，TBST洗滌3次；以GAPDH(1∶2000)為內參。辣根過氧化物酶顯影，Ⅰmage J軟件分析灰度值，以與GAPDH灰度的比值作為蛋白相對表達量。

1.3.5 免疫熒光染色

每組5只大鼠10%水合氯醛5 ml/kg腹腔注射麻醉，打開胸腔，剪開右心耳，從左心室灌注4℃生理鹽水約250 ml，待右心耳流出清亮液體時，換4%多聚甲醛PBS溶液(pH=7.4)灌注約250 ml后取腦組織，海馬區(qū)冰凍切片。高溫抗原修復，常規(guī)畫圈，滴加打孔液15 min；10%山羊血清封閉1 h，加兔抗Ki67一抗(1∶100)、小鼠抗 DCX(1∶50)和兔抗 Neun一抗(1∶300)，4℃過夜；PBS沖洗3次，滴加Alexa Fluor488標記的山羊抗兔ⅠgG二抗(1∶500)和Alexa Fluor555標記的驢抗小鼠ⅠgG二抗(1∶500)，室溫2 h，PBS沖洗3次，DAPⅠ復染15 min，10%甘油封片。每只各取1張切片熒光顯微鏡下觀察，Adobe Photoshop CS6軟件中行陽性細胞計數。

1.3.6 高爾基染色實驗

每組6只大鼠斷頭取腦，腦組織于4%多聚甲醛溶液中固定1 d；換高爾基染液，2 d后換新，以后每3天換新，共14 d；15%糖水脫水1 d，30%糖水脫水2 d；蒸餾水洗1 min，濃氨水處理45 min，蒸餾水洗1 min，酸性堅膜定影液處理45 min，蒸餾水洗1 min；30%糖水4℃脫水3 d；海馬區(qū)冰凍切片，厚20 μm，光鏡下觀察海馬樹突發(fā)育情況。選取樹突長度相同的海馬神經元，用Ⅰmage J 1.52a軟件計算樹突棘數量。

1.4 統計學分析

采用SPSS 23.0軟件進行統計學處理。所有數據均用(xˉ±s)表示。采用單因素方差分析，行方差齊性檢驗，若方差齊，行LSD-t檢驗，若不齊行Games-Howell檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 挖穴試驗

訓練前，模型組和游泳組較假手術組挖穴能力下降(P＜0.05)。隨著游泳次數增加，游泳組剩余沙粒數減少，第3周和第4周，游泳組挖穴能力優(yōu)于模型組(P ＜0.05)。見表1。

2.2 BDNF和TrkB蛋白表達

模型組和游泳組海馬BDNF、TrkB蛋白表達均較假手術組下降(P＜0.05)，游泳組高于模型組(P＜0.05)。見圖1、表2。

2.3 Ki67/DCX和Neun表達

模型組和游泳組Ki67、DCX和Neun陽性細胞率均低于假手術組(P＜0.05)，游泳組高于模型組(P＜0.05)。見表3、圖2、圖3。

表1 大鼠挖穴試驗剩余沙粒質量(g)

圖1 大鼠海馬區(qū)Western blotting結果

2.4 樹突復雜性

模型組和游泳組神經細胞樹突棘數量均低于假手術組(P＜0.05)，游泳組高于模型組(P＜0.05)。見表4、圖4。

表2 各組海馬BDNF、TrkB蛋白表達比較(灰度比)

圖2 大鼠海馬齒狀回Ki67和DCX表達(免疫熒光染色,×200)

圖3 大鼠海馬齒狀回Neun表達(免疫熒光染色,×200)

圖4 大鼠海馬區(qū)域樹突(高爾基染色，×400)

表3 各組海馬Ki67、DCX和Neun陽性細胞率比較

表4 各組海馬神經細胞樹突棘數量比較(n)

3 討論

細胞核增殖相關抗原ki67是檢測細胞增殖的常用指標[20]，DCX是在遷移和分化的神經元上表達的一種微管相關蛋白，主要參與神經元前體細胞的增殖[21]，二者含量增加代表神經細胞增殖再生能力增強。運動可增加神經細胞分化增殖和樹突的復雜性(包括長度和密度)[22]，樹突及樹突棘的數量越多，接受神經元刺激的面積越大，越容易傳導細胞沖動。

本研究顯示，有氧運動可促進海馬神經增殖分化，增加Ki67、DCX的表達。長期(6～12個月)有氧運動增加前額葉皮層白質和灰質體積，以及胼胝體連接性[23]，促進前額葉皮質在認知損害中的康復[24]，中小強度的有氧加力量的混合運動也能夠促進老年大鼠的海馬神經發(fā)生[25]。我們推測，有氧運動可以使海馬神經增殖再生，并改善CSⅤD患者認知障礙中海馬相關的執(zhí)行功能。

運動誘發(fā)的認知收益可能是多種機制綜合作用的結果。Etnier等[26]認為，心血管健康可能是級聯機制的一個組成部分，首先有氧運動可以改善心血管健康，這可能因為有氧運動增加血管壁的機械剪應力，上調基質細胞衍生因子-1增加腦血管新生[27]，促進腦血液循環(huán)和腦氧合增加，增加血腦屏障通透性，更有效地傳遞神經營養(yǎng)因子[28]。運動會激活海馬N-甲基-D-天冬氨酸受體，促進BDNF表達和神經發(fā)生[29]，其機制可能在成熟的海馬齒狀回顆粒神經元中產生。顆粒神經元增加BDNF的產生，可以激活部分神經細胞上TrkB，通過觸發(fā)cAMP反應元件結合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB)依賴性轉錄，誘導它們募集到細胞周期中，增加CREB的磷酸化，并刺激神經元類胰島素生長因子-1(insulin-like growth factor gene,ⅠGF-1)的攝??；隨著更有效的血流遞送，升高的ⅠGF-1可到達更多神經元，進一步增加CREB介導的BDNF表達[30]。CREB和BDNF在反復運動后上升，可促進神經發(fā)生，海馬區(qū)神經可塑性也隨之增加，引發(fā)功能改善，如執(zhí)行功能和記憶改善[31]。

孫竹梅等[32]發(fā)現，有氧運動預處理可促進腦缺血再灌注后神經細胞存活和軸突再生；Lin等[33]發(fā)現，學習和記憶任務的表現隨身體鍛煉而改善；Thacker等[34]也發(fā)現，執(zhí)行功能通過有氧運動得到改善；Li等[35]的臨床試驗顯示，阻力訓練有助于改善老年人的執(zhí)行功能和整體認知功能。以上研究均與本研究結果相似。

對于某些認知領域，如執(zhí)行和記憶，神經保護對認知的客觀改善，要到老年認知衰退期才變得明顯，因為這是大腦發(fā)生重大結構變化的時候[36]。有氧運動有助于緩解與年齡相關的認知衰退，尤其是與腦血管功能障礙，如CSⅤD相關的認知障礙。