運動預處理對大鼠腦缺血再灌注損傷后血腦屏障通透性的影響

梁碧瑩，朱路文，唐強，葉濤，李宏玉，李保龍，阮野

1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江哈爾濱市150040；2.黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院，黑龍江哈爾濱市150001；3.貴陽中醫學院第一附屬醫院，貴州貴陽市550000

腦卒中是由于腦部血管突然破裂或因血管阻塞，導致血液不能流入大腦，而引起腦組織損傷的一種急性腦血管疾病。缺血性腦卒中占腦卒中的70%～80%，造成患者運動、感覺、言語、認知等功能障礙[1-2]。腦缺血致腦細胞損傷，灌注恢復后，損傷反而進一步加重，稱為缺血再灌注損傷。

腦缺血再灌注損傷可能與血腦屏障功能紊亂有關?？p隙連接作為相鄰細胞間的直接通道，是進行細胞間直接信息交流的基礎。星形膠質細胞之間存在最廣泛的縫隙連接。連接蛋白43(connexin 43,Cx43)是縫隙連接主要組成部分，泛連接蛋白1(Pannexin 1,Panx1)是Pannexins家族的重要成員之一，兩者均參與腦缺血再灌注損傷，作用機制較為復雜[3]。

運動預處理是指在缺血前給予大量重復運動訓練，能夠誘導腦缺血耐受。前期研究證實，運動預處理發揮腦保護作用，與降低炎癥反應、抑制谷氨酸興奮性、減少細胞凋亡有關[4-5]。本文探討運動預處理對大鼠腦缺血再灌注損傷后血腦屏障通透性及Cx43和Panx1蛋白的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康成年SPF級雄性Sprague-Dawley大鼠54只(北京維通利華實驗動物有限公司)，許可證號SYXK(京)2010007，體質量(220±10)g。安靜環境、溫度(21±2)℃、12 h明暗交替、清潔級飼養，環境適宜，通氣良好，大鼠自由進食進水。飼養、實驗過程均遵照科技部《實驗動物管理條例》執行。

隨機數字表法分為假手術組、模型組和運動預處理組，每組18只。模型組自由活動3周，制備大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型，缺血2 h后恢復灌注；假手術組自由活動3周，僅接受手術操作，線栓插入深度1 cm，不進行再灌注；運動預處理組跑臺訓練3周，制備MCAO模型，缺血2 h后恢復灌注。

最后所有大鼠均安樂死處理。

1.2 器材和主要試劑

ZH-PT型動物運動跑臺：徐州利華電子。移液器：德國EPPENDORF公司。WD-9413B型凝膠成像分析系統：北京六一生物科技有限公司。DY89-ⅠⅠ電動玻璃勻漿機：寧波新芝生物科技股份有限公司。Multiskan FC型酶標儀：美國THERMO公司。小動物麻醉機：深圳瑞沃德生命科技有限公司。激光多普勒血流儀：瑞典PERⅠMED公司。

伊文思藍：美國SⅠGMA公司。甲酰胺：溫州長風生物有限公司。Cx43、Panx1抗體：北京博奧森生物技術有限公司。兔二步法試劑盒：中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 模型制備

采用Koizumi[6]改良線栓法制備大鼠MCAO模型。使用小動物麻醉機麻醉大鼠，俯臥放置于手術臺上，顱頂正中切口，生物膠垂直固定光纖于前囟后2 mm右側旁開5 mm。激光多普勒血流儀探測大鼠血流值。

大鼠仰臥、固定，頸部常規消毒、備皮，頸正中偏右切口。結扎頸總動脈主干和頸外動脈，石蠟包裹的魚線插入頸內動脈，深18～22 cm。激光多普勒血流儀監測血流阻閉，MCA血流降至基線值的30%以下視為造模成功。2 h后緩慢拔出線栓至頸總動脈主干分叉處。血流達基礎血流的70%，視為再灌注成功。

1.3.2 運動預處理

運動預處理組予跑臺訓練，速度15 m/min，坡度0°，電擊刺激強度1.5 mA，每天訓練30 min，每周6 d，共3周。

1.4 檢測指標

1.4.1 改良神經功能評分(modified Neurologic Severity Score,mNSS)

再灌注24 h后，采用mNSS評分[7]評估大鼠神經功能缺損程度。mNSS評分包括行動能力測試、感覺測試、反射測試3大項，14小項，總分14分。評分越低，損傷程度越輕。

1.4.2 血腦屏障通透性

評分后，大鼠麻醉，股靜脈注射2%伊文思藍溶液4 ml/kg。2 h后，生理鹽水心臟灌流，至右心房流出澄清液體，取出每組6只大鼠腦組織10 ml/g浸入甲酰胺溶液中，勻漿，60℃恒溫水浴孵育24 h，4000 r/min離心20 min，取上清。酶標儀測量光密度(optical density,OD)值。根據標準曲線讀出伊文思藍濃度。

1.4.3 Western blotting

每組6只大鼠腦組織-80℃冰箱凍存。蛋白質抽提，制備蛋白上樣液。電泳、轉印、封閉，加Cx43一抗(1∶8000)、Panx1 一抗(1∶1000)、內參 GAPDH一抗(1∶2000)孵育，加二抗孵育。取出PⅤDF膜浸入TTBS中，搖床搖動5 min，重復4次；加ECL發光液，靜置5 min。暗室曝光。全自動化學發光圖像分析系統掃描，計算目的蛋白與內參GAPDH的比率。

1.4.4 免疫組化染色

每組6只大鼠腦組織石蠟切片。脫蠟、入水、沖洗、高壓修復，置PBS中。滴加山羊血清封閉液，室溫 20～30 min。加 Cx43 一抗(1∶60)和 Panx1 一抗(1∶60)，4℃過夜?；謴椭潦覝睾?，PBS沖洗3次。滴加即用型二抗，37℃避光20 min，PBS沖洗3次。DBA顯色5～10 s，水洗終止；蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片。顯微鏡觀察，Ⅰmage-Pro Plus軟件行圖像分析，計算目的蛋白表達面積與組織總面積的比率。

1.5 統計學分析

采用SPSS 22.0統計軟件對數據進行統計分析。數據用(xˉ±s)表示。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 mNSS評分

假手術組未出現神經功能缺損表現。與模型組比較，運動預處理組的神經功能缺損評分降低(P＜0.05)。見表1。

表1 各組神經功能缺損評分比較

2.2 血腦屏障通透性

模型組伊文思藍含量高于假手術組(P＜0.05)。與模型組比較，運動預處理組伊文思藍含量下降(P＜0.05)。見表2。

表2 各組大鼠伊文思藍含量比較(μg/g)

2.3 Western blotting

與假手術組比較，模型組Cx43和Panx1蛋白表達增加(P＜0.05)。與模型組比較，運動預處理組Cx43和Panx1蛋白表達下降(P＜0.05)。見表3、圖1。

表3 各組腦組織Cx43、Panx1蛋白表達

2.4 免疫組化染色

圖1 各組Cx43、Panx1蛋白表達

假手術組細胞輪廓清晰，有Cx43和Panx1陽性表達。模型組細胞輪廓模糊，出現大量Cx43和Panx1陽性表達。運動預處理組細胞形態明顯恢復。與假手術組比較，模型組Cx43和Panx1陽性表達增加(P＜0.05)。與模型組比較，運動預處理組Cx43和Panx1陽性表達降低(P＜0.05)。見表4、圖2、圖3。

3 討論

預處理的概念于1986年首次提出。Murry等[8]發現，缺血預處理可減輕致死性缺血發生，認為存在缺血耐受現象。1990年，Kitagawa等[9]證實腦缺血耐受的存在。預處理是指經過多次重復干預，對隨后的致命傷害可以產生保護[10]。運動預處理可操作性強，安全性高，不易產生疼痛和損傷。既往研究表明[11-12]，連續3周運動預處理可降低大鼠腦缺血后的炎癥反應，減少腦梗死體積、腦水腫，降低神經功能缺損，也可通過調節腦血流量保護大腦，降低缺血性損傷。運動預處理具有腦保護作用[13]，作用機制具有多水平、多通道、多靶點的特點。前期研究發現[14-15]，運動預處理可以調節Toll樣受體4、核轉錄因子κB，抑制炎性反應；也可以降低腦缺血再灌注大鼠血清白細胞介素-1β、白細胞介素-6和腫瘤壞死因子α含量。運動預處理還可通過促進神經血管再生、抑制谷氨酸興奮性毒性、減小細胞凋亡等，發揮腦保護作用[16]。

表4 各組Cx43和Panx1陽性面積比率比較

圖2 各組Cx43蛋白表達(免疫組化染色,×400)

圖3 各組Panx1蛋白表達(免疫組化染色,×400)

循環中的染料可以染色大多數組織和器官，但正常情況下大腦無法被染色，這是由于血液和大腦間存在血腦屏障[17]。伊文思藍可以迅速與白蛋白結合，當血腦屏障被破壞時，伊文思藍可以隨白蛋白滲漏至腦組織中，因此常用伊文思藍法測量血腦屏障通透性。腦缺血后，血腦屏障通透性改變是腦水腫發生的重要原因[18]。血腦屏障結構和功能的改變與缺血再灌注損傷關系密切，血腦屏障通透性增加會引起腦水腫和其他并發癥[19]。

神經膠質細胞是血腦屏障的構成成分，可以維護血腦屏障的生理功能[20]。Cx43和Panx1是星形膠質細胞的重要組成，二者在腦卒中后有較為復雜的作用[21]。Cx43廣泛分布于星形膠質細胞終足，其表達增加會破壞血腦屏障通透性，導致一些大分子物質可以透過血腦屏障，加重腦水腫[22]。也有研究認為[23]，Cx43可起到保護作用，可能與釋放ATP有關。Panx1通道參與腦水腫過程，其抑制劑可以抑制大鼠腦缺血后水通道蛋白4表達，使大鼠腦組織水含量減少，腦水腫程度減輕[24]。使用Panx1阻斷劑也可明顯阻斷其神經保護作用，認為Panx1對腦缺血有一定保護作用[25]。Cx43和Panx1作用復雜，兩者在缺血性腦卒中疾病中發揮重要作用，需要深入研究。

本研究顯示，大鼠腦缺血再灌注24 h后，運動預處理組mNSS評分降低，伊文思藍含量、Cx43和Panx1蛋白表達降低。表明運動預處理可以減輕腦損傷，改善神經功能，改善血腦屏障通透性，維持血腦屏障完整，下調Cx43和Panx1蛋白表達，發揮腦保護作用。臨床可以制定合理的運動預處理方案，降低腦血管疾病發病率，減輕患者患病后的腦損傷。