利用SSR標記分析26份南瓜種質的遺傳多樣性

周秦，郭子卿，朱璞，徐誠，徐恒輝

(1.金華市農業科學研究院，浙江 金華 321000； 2.金華雙依種子有限公司，浙江 金華 321000)

南瓜屬(Cucurbita)是一個大族群，種質資源十分豐富，因其抗逆性強，適應性好，地域分布廣，高產耐貯，果實形狀、大小、品質各異，果色繽紛多彩，現已在世界各地廣泛栽培[1]。隨著人們對南瓜營養價值認識的增加，對南瓜屬資源利用的深入，以及在南瓜進行不同品種間雜交試驗過程中，研究者們逐漸意識到南瓜種質資源研究的重要性，狹窄的遺傳基礎難以培育出突破性品種[2]。

SSR(simple sequence repeats，微衛星序列即簡單重復序列)分子標記技術，具有多態性高、操作簡單、重復性好、穩定性高、成本低廉、呈共顯性等優點，已被廣泛應用于親緣關系分析，指紋圖譜構建等[3]。盧亞楠等[4]利用RAPD、ISSR和SSR三種標記方法對36份西葫蘆(美洲南瓜)的親緣關系進行了分析鑒定，三種標記中SSR標記的多態性最高。Gong等[5]采用SSR標記和SCAR標記對104份美洲南瓜種質資源進行了遺傳多樣性和親緣關系的鑒定，134對SSR引物和4個SCAR標記共擴增出418個位點，分布于20個連鎖群。劉超[6]采用35對SSR引物對76份不同來源的籽用南瓜種質資源進行SSR檢測，發現SSR標記能夠準確地將種質依據來源進行分類。

本研究利用SSR標記技術分析26份南瓜種質資源的遺傳多樣性并進行類群劃分，估計其遺傳距離和性狀分類距離的相關性，以期為育種者開展種質鑒定與創新、優良品種選育和親本組配等研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料共26份(表1)，均為金華市農業科學研究院蔬菜所南瓜育種課題組經過收集、試種篩選獲得，分別為筍瓜、中國南瓜、中國南瓜與筍瓜雜交材料，主要來源于日本和國內其他地區引進的材料，少量為浙江省內的農家留種。

表1 參試南瓜的品系及來源

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取

26份供試材料于3月5日播種于育苗聯棟大棚，3月31日取其第二片真葉約0.5 g，采用改良CTAB法進行DNA提取，利用紫外分光光度計和瓊脂糖檢測DNA質量、濃度。將基因組DNA原液于-20 ℃保存，PCR擴增時取適量稀釋為25 ng·μL-1備用。

1.2.2 SSR引物合成與PCR擴增

選擇26對SSR引物[7](表2)，由金斯瑞生物科技有限公司合成，Taq酶購自金斯瑞生物科技有限公司。PCR實驗體系15 μL，其中dNTPs 2.4 μL(1.25 mol·L-1)，引物各0.2 μL(10 μmol·L-1)，酶0.2 μL(5 U·μL-1)，10×緩沖液1.4 μL(含Mg2+)，DNA約40 ng。反應程序為95 ℃退火5 min，94 ℃變性1 min，54 ℃(不同引物復性溫度不同)復性45 s，72 ℃延伸1 min，4 ℃保存10 min。

表2 SSR引物序列與名稱

PCR產物采用6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染檢測。方法：取下膠板，純凈水沖洗2次；放入0.2% AgNO3中染色15 min；取出純凈水沖洗2遍；放入顯影液中：15 g NaOH+7 mL甲醛+2 L水；取出水洗，照相。

1.2.3 數據統計與分析

根據SSR標記顯示的帶型，記錄易于辨認且擴增結果穩定的多態性位點，根據各條帶的遷移率及其有無統計得到所有位點的二元數據，有條帶記為“1”，無條帶記為“0”。應用非加權平均數法UPGMA進行聚類分析，通過NTSYS[8]遺傳分析軟件程序運算，利用Tree-Plot模型繪制生成樹狀圖。根據Smith等[9]的方法計算標記位點的多態信息量PIC(polymorph ism index content)值，PIC值反映某一群體中遺傳多樣性豐富程度，PIC值與等位基因的數目有關，并與等位基因的頻率有關[10]。

2 結果與分析

2.1 SSR標記多態性

從26對SSR引物中共篩選出22對擴增結果較好的引物，能明顯擴增出穩定多態性條帶(圖1)。在26份南瓜材料中共檢測出98個等位基因變異，每對引物的等位基因變異數為1～12個，平均為4.5個；其中引物CMTp260擴增的等位變異最多達12個，引物CMTp145擴增的等位變異最少為1個。SSR標記的多態信息量PIC為0.148(CMTp145)～0.840(CMTp260)，平均為0.460(表3)。

圖1 引物CMTp256對26份南瓜材料DNA的擴增結果

編號引物名稱等位變異數多態性信息含量編號引物名稱等位變異數多態性信息含量1CMTp19380.71312CMTp14240.4462CMTp9860.62813CMTp5830.4493CMTp13120.39714CMTp14510.1484Cmtp18760.66815CMTp6640.3965CMTp6340.30216CMTp260120.8406CMTp8890.78417CMTp6930.5017CMTp23540.26618CMTp17640.2588CMTp25640.45719CMTp8630.2039CMTp22470.75220CMTp16930.27810CMTp24830.35021CMTp23130.15611CMTp25730.55422CMTp20920.500

2.2 聚類

根據遺傳相似性系數矩陣，用UPGMA法進行聚類分析，得到26份供試材料的遺傳關系樹狀圖(圖2)，可分成2個類群。第Ⅰ類群較大，共有23份材料，均為筍瓜類型，分成6個亞群：第1個亞群僅1份材料(1號)；第2個亞群包括11份材料(3號、18號、14號、22號、9號、21號、7號、17號、11號、8號、10號)，其中3號和18號親緣關系很近，本試驗所用的22對引物無法將其區分開來，可能是姊妹系，8號和10號較好地聚在一起，且10號的系譜信息顯示其含有25%的8號的血緣；第3個亞群包括7份材料(4號、5號、16號、15號、20號、24號、25號)，其中4號、5號、16號較好地聚在一起，根據系譜信息顯示三者為同質遺傳型組成品種的再組合；第4個亞群僅1份材料(12號)；第5個亞群包括2份材料(2號、19號)；第6個亞群僅1份材料(23號)。

第Ⅱ類群共有3份材料，與第Ⅰ類群的遺傳距離較遠，達0.4。分成2個亞群：第1個亞群包括2份材料(6號、26號)，均為中國南瓜類型；第2個亞群僅1份材料(13號)，為中國南瓜與筍瓜雜交所得，與其余品系的遺傳距離最遠，相比于筍瓜類型與中國南瓜類型更靠近。利用SSR分子標記做出的聚類結果基本可以將供試材料按照不同品種群分開，這與前人按照植物化學分類法(主要是同工酶及等位酶)進行種內分類的結果是相符的[11]。

3 小結與討論

本試驗結果表明，筍瓜與中國南瓜間的親緣關系相對較遠，這與其他采用不同標記手段得出的分類結論一致[12-13]。在南瓜育種中，選擇遺傳差異豐富的親本進行雜交可以擴大遺傳基礎。利用SSR分子標記可以從分子水平上區分不同品種間的遺傳距離，不受環境條件對植物形態的影響，十分穩定可靠，是一種理想的遺傳多樣性分析技術。本研究利用26對南瓜SSR引物，對26份南瓜種質材料進行遺傳多樣性分析，其中22對引物能明顯擴增出穩定的多態性條帶，共檢測出98個等位基因變異，平均每對引物的等位基因變異數為4.5個，平均多態信息量為0.46。26份材料可以分為2個類群，與可追溯的系譜信息基本一致。

1～26為品種編號見表1圖2 26份南瓜種質聚類結果

研究結果表明，收集到的南瓜種質資源中，2份中國南瓜材料之間差異較大，23份筍瓜材料的種間遺傳組成上差異較小，遺傳基礎狹窄，品種(系)間的遺傳多態性不豐富，推測可能多為同質遺傳型組成品種的再組合。因此，還需要繼續收集更多的國內外種質材料，加大新材料的引進力度，加強親緣關系較遠地區間的基因交流及關鍵基因挖掘；在傳統育種的基礎上結合遠緣雜交、胚挽救、輻射誘變等生物技術手段的應用，積極開展種間雜交試驗，進而建立雜種優勢利用模式，為南瓜種質資源保存和新品種選育提供理論依據。