響應曲面法優化五味子果實中蘆丁的微波提取工藝

劉俊霞，趙大偉，王浩博，李佳麗

（吉林農業科技學院生物與制藥工程學院，吉林吉林 132101）

五味子（Schisandra chinensis）是木蘭科五味子屬植物，主產地為我國東北三省，是藥食同源食品[1]。關于五味子化學成分的研究，以活性成分木脂素含量變化的研究較多，但結果不盡相同[2]。為更好地利用五味子果實中的黃酮類物質，本研究將采用微波提取法，以蘆丁為考察指標，在單因素試驗基礎上，采用Box-Behnken試驗設計篩選五味子果實中黃酮的最佳提取工藝，提供一個從五味子中提取黃酮的較為有效的方法。

1 材料與儀器

XH-100A微波超聲波合成儀（北京祥鵠科技發展有限公司）、1260型高效液相色譜儀（安捷倫）、R1001-VN型旋轉蒸發儀（鄭州長城科工貿有限公司）、SHB-III型循環水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）、SE602F型電子天平（奧豪斯儀器（上海）有限公司）、HP-010型真空泵（天津市恒奧科技發展有限公司）、FB-01T過濾器。標準品蘆丁（A0103）購買于成都曼思特生物科技有限公司，純度大于98%。所用試劑均為分析純。

五味子2017年6月采自于吉林農業科技學院藥用植物資源圃。經吉林農業科技學院教師李赫男鑒定為五味子科（Schisandraceae）五味子屬（Schisandra）五味子〔Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.〕的果實。

2 方法與結果

2.1 五味子果實的處理

將五味子果實粉碎，置于55℃烘箱中烘至恒重，過40目篩后備用。

2.2 五味子果實中黃酮含量測定

2.2.1 溶液的制備

2.2.1.1 對照品溶液精確稱取蘆丁對照品各1mg放于10mL的容量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得質量濃度為0.1mg/mL的對照品溶液，置4℃冰箱中保存[3]。

2.2.1.2 供試品溶液制備精密量取單因素溶液和響應面曲線法制得的五味子果實溶液50μL，進入HPLC檢測其黃酮含量。

2.2.2 色譜條件

色譜柱為 ZORBAX SB-C18（4.6×150mm，5μm）；流動相為甲醇（A）－0.2磷酸水溶液（B），洗脫梯度為 0～40min 40%A～50%A；流速1mL/min；柱溫30℃；進樣量50μL；在355nm波長處進行檢測[4]，色譜圖見圖1。

圖1 蘆丁對照液HPLC圖

2.2.3 標準曲線的繪制

取配制的對照品溶液，進樣 1 μL、2μL、3μL、4μL、5μL，按色譜條件進行色譜分析，記錄色譜峰面積，以色譜峰面積（y）為縱坐標，質量濃度（x）為橫坐標，繪制標準曲線，求出黃酮線性回歸方程y=1.1007×103x－8.5998，表明在0～0.5 mg/mL線性范圍良好。

2.2.4 方法學考察

2.2.4.1 精密度試驗 精密吸取對照品溶液，重復進樣5次，進樣量10μL，按色譜條件進行 HPLC分析，記錄峰面積。結果顯示，黃酮峰面積的RSD值為1.21%（n=5），表明儀器精密度良好。

2.2.4.2 重復性試驗 取同一批樣品3份，按“2.2.1.2”方法制備成供試品溶液，按色譜條件進行HPLC分析，記錄峰面積，測得黃酮峰面積的RSD值為0.96%，表明本方法的重復性良好。

2.2.4.3 穩定性試驗 取同一供試品溶液分別放置0h，2h，4h，6h，8h，12h，24h后按上述色譜條件下進樣測定，記錄峰面積，計算黃酮含量。結果顯示，供試品溶液中黃酮含量的RSD值為1.24%（n=5），結果表明，供試品溶液在24h內穩定性良好。

2.2.4.4 加樣回收率試驗 精密稱取5份已知上述黃酮含量的五味子粉末5.0000g，各精密加入適量的對照品溶液，按“2.2.1.2”法制備樣品溶液，按照上述色譜條件進行檢測分析，測定黃酮的含量。根據測得量和加入量，計算各成分的加樣回收率，結果符合定量測定要求，表明本法準確可靠，詳見表1。

表1 加樣回收率試驗結果（n=5）

表2 響應面試驗因素水平表

表3 黃酮提取試驗Box-Benhnken設計及結果

表4 黃酮Box-Benhnken試驗回歸模型的方差分析

3 響應面法優化五味子果實中黃酮的微波提取工藝

在微波提取法單因素試驗的基礎上，選取乙醇濃度（X1）、料液比（X2）、提取次數（X3）、提取功率（X4）四個因素，通過Design-Expert8.0.6軟件進行Box-Benhnken的響應面設計和數據分析，具體試驗因素與各水平值見表2。

根據Box-Benhnken的組合設計原理，采用Design-Expert8.0.6軟件設計四因素三水平共29個試驗，其中心點重復5次試驗，以黃酮含量為響應值，具體試驗設計方案與結果見表3。

利用Design－Expert8.0.6軟件對表3中的數據進行多元擬合，得到黃酮對乙醇濃度（X1）、料液比（X2）、提取次數（X3）、提取功率（X4）的二元多項模型方程為：

Y蘆丁=-3.37851+0.050699 ×A+0.055716×B+0.37690×C+3.31805×10-3×D+4.56000×10-4×A×B+2.28250×10-3×A×C+3.97500×10-6×A×D－6.69000×10-3×B×C+1.94500×10-5×B×D-1.20750×10-4×C×D-7.23800×10-4× A2－1.66770×10-3×B2－0.037705×C2－2.33425×10-6×D2。對該模型進行方差分析，結果見表4。從表可以看出模型的F=4.02、P=0.0069，表明模型對提取工藝影響極顯著。R2=0.8008，變異系數（C·V%）為 16.27%，Radj2=0.6015，表明模擬程度良好，試驗誤差較小。根據回歸方程中的各項系數及表4回歸方程的方差結果可知，在所選因素范圍內各個因素對五味子黃酮提取含量的影響順序：料液比＞提取次數＞提取濃度＞提取功率。響應面曲面可較直觀的反映各因素及兩兩因素的交互作用對響應值（黃酮含量）的影響，五味子微波提取的響應面3D圖見圖2，結果表明料液比對微波提取黃酮含量影響最大，提取功率影響最小。

運用Design-Expert8.0.6軟件優化得到的微波提取黃酮最佳提取工藝為乙醇濃度49.08%，料液比為1∶20.93，提取次數為3.43次，提取功率為751.2W，在此條件下黃酮的含量為0.33998mg/mL。考慮到微波功率為整數，將提取條件調整為乙醇濃度50%，料液比為1∶21，提取次數為4次，提取功率為800W。

4 結論

本研究以五味子果實中蘆丁為檢測目標，使用微波提取技術提取五味子中黃酮成分，通過四因素，三水平的Box-Benhnken設計優化得到最佳的微波提取工藝，可為五味子中蘆丁提取提供技術支撐，為拓寬五味子中黃酮化合物的綜合利用途徑提供思路。