安介導等溫擴增法對蝦醬中致病菌檢測結果的分析

林青

（海南省食品檢驗檢測中心，海南海口570314）

傳統國標方法中食品的致病菌檢測需要5～7天，對于海南博鰲年會或上海世博會等短期的會議活動而言檢驗時限太長，已經不能滿足會議食品安全保障的需要。現今針對食源性致病菌快速檢測的方法有：免疫磁珠法[1-3]、MALDI-TOF MS法[4]、恒溫熒光 PCR法[5]、拉曼光譜法[6]、實時熒光定量PCR法[7]等。恒溫熒光PCR全稱是環介導等溫擴增技術（LAMP），采用恒溫擴增DNA技術，通過Bst聚合酶及特異性引物在恒溫條件下對致病菌核酸片段進行特異性擴增，擴增后產物DNA與核酸染料結合發出熒光信號，最后根據所產生的擴增曲線判斷結果。LAMP技術反應程序在63℃條件反應45～60min后可以將少量的靶核酸分子擴增到106分子水平。

本實驗采用環介導等溫擴增法快速檢測海鮮制品蝦醬中的沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌和大腸桿菌O157等5種常見致病菌。

1 材料與方法

1.1 材料

所有樣品來源于送檢樣品。

1.2 試劑

細菌基因組DNA快速提取試劑盒、沙門氏菌核酸檢測試劑盒、志賀氏菌核酸檢測試劑盒、金黃色葡萄球菌核酸檢測試劑盒、副溶血性弧菌核酸檢測試劑盒、大腸桿菌O157核酸檢測試劑盒購于廣州迪澳生物科技有限公司。

1.3 儀器

MMK金屬浴、Deaou-308C恒溫熒光擴增儀（廣州迪澳生物科技有限公司）。

1.4 檢測方法

實驗樣品根據國家GB4789系列標準進行前增菌，然后按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明提取模版DNA，將含有模版DNA的提取液加入核酸檢測試劑盒中，同時加入陰性對照和陽性對照，然后上機檢測。

圖1

2 結果與分析

陰性和陽性對照結果正常，樣品結果顯示副溶血性弧菌疑似陽性，沙門氏菌、金葡菌及大腸桿菌O157等致病菌為陰性，詳見圖1。

對環介導等溫擴增法檢測出的副溶血性弧菌陽性樣品按國標4789.7-2013方法檢測檢出溫和氣單胞菌、棲稻假單胞菌。針對環介導等溫擴增快速檢測顯示致病菌陽性，而國標方法未檢出這一情況分析存在以下可能：一是樣品中可能存在一定量非存活的致病菌。致病菌不是活菌，因此常規檢驗不能被培養出來，但環介導等溫擴增法的原理是在細菌DNA擴增的基礎上利用熒光信號而顯示結果，所以雖然是死菌，但仍然能被檢出[8]。二是蝦醬是高鹽分產品，快速提取的DNA模板可能含有較高的離子濃度，從而影響PCR體系而導致出現了假陽性的可能。

3 結論

對于某些樣品檢驗時應充分考慮樣品特性，可選擇多樣的檢測手段，防止假陽性結果的產生。作為一種新的技術手段恒溫核酸擴增技術具有檢測速度快、檢測成本較低、檢測時間短等優點，能加快傳統方法檢測致病菌的速度，滿足食品快速通過的檢驗要求，值得推廣使用。