中藥補肺活血膠囊對細顆粒物所致小鼠肺損傷修復的影響?

敬 岳，金 津，唐詩環，曹乃芹，廖 強，陳 燕，蔡 哲，張洪春△

(1. 中國中醫科學院望京醫院，北京 100102； 2. 北京中醫藥大學，北京 100029； 3. 中日友好醫院中醫肺病科,中日友好醫院呼吸中心；國家呼吸疾病臨床研究中心,北京 100029； 4. 中日友好醫院臨床研究所，北京 100029)

細顆粒物指環境空氣中空氣動力學當量直徑小于等于2.5 μm的顆粒物，具有粒徑小、面積大、活性強的特點，容易富集空氣中有毒重金屬、酸性氧化物、有機污染物以及細菌和病毒等。細顆粒物在空氣中停留時間長、輸送距離遠且從呼吸道進入人體，因此可直接引起呼吸系統疾病的發生。補肺活血膠囊主要藥物組成有黃芪、赤芍、補骨脂，具有益氣活血、補肺固腎的作用。相關臨床及基礎研究提示，補肺活血膠囊可提高機體免疫力，緩解慢性支氣管炎及支氣管哮喘疾病患者的相關臨床癥狀，如咳嗽、咳痰、喘息、心悸、氣短等癥狀[1]，也可緩解慢性阻塞性肺疾病穩定期患者的相關臨床癥狀[2]。本研究將通過相關實驗研究進一步觀察補肺活血膠囊對細顆粒物所致小鼠肺損傷與修復過程的影響。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級ICR健康雌性小鼠70只，體質量18～20 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，許可證號SCXK(京)2014-0004)。在溫度22～28 ℃，相對濕度50%～60%的清潔環境中飼養，適應性飼養1周，隨機分為空白對照組、低劑量染毒組、低劑量染毒中藥組、中劑量染毒組、中劑量染毒中藥組、高劑量染毒組和高劑量染毒中藥組7組各10只。

1.2 實驗中藥

補肺活血膠囊組成有黃芪、赤芍、補骨脂，為已上市中成藥補肺活血膠囊，由雷允上藥業有限公司提供，經國家食品藥品監督管理總局認證通過批號(Z20030063)。

1.3 實驗儀器與試劑

1.3.1 儀器 Anderson型顆粒物采樣器HBL-GUV(Thermo公司)；MK3酶標儀(上海雷勃分析儀器有限公司)；自動控溫離心機(日本 HITACHI公司)；T10 basic型自動組織勻漿機(德國 IKA 公司)。

1.3.2 試劑 細顆粒物懸液、KGF抗體(小鼠，英國 Biorbyt公司)；免疫組化試劑盒(基因科技(上海)有限公司)；IL-4、IL-17 ELISA試劑盒(小鼠，美國R&D公司)。

2 方法

2.1 細顆粒物懸液與補肺活血中藥溶液制備

細顆粒物采集于2011年12月至2012年1月北京四環路中段保福寺橋和學院橋之間，用Anderson型顆粒物采樣器HBL-GUV(Thermo公司)采用聚四氟乙烯濾膜采樣細顆粒物，采樣器安置于距道路寬2 m，距地面高1.8～2.5 m處，連續2周, 將載有顆粒物的濾膜剪裁成1 cm×3cm 大小, 浸入去離子蒸餾水中, 超聲振蕩40 min×3次,洗脫顆粒物, 震蕩液經6層紗布過濾, 濾液4 ℃、12000 r min 離心30 min, 收集下層懸液冷凍真空干燥、 稱重，低溫冰箱保存備用。用生理鹽水配成所需濃度后超聲震蕩15 min,混勻并滅菌 4 ℃保存,臨用前振蕩使顆粒物充分混勻。相關研究表明，我國細顆粒物水溶性無機成分主要有NO-、SO2-、NH+4、Cl-、K+[4-5]。補肺活血中藥溶液制備：去除膠囊外殼將補肺活血膠囊內藥粉按照一定比例與20 ℃蒸餾水充分溶解。

2.2 模型建立與干預方法

空白對照組：分別于模型建立第1、8、15和22天經鼻腔滴入0.9%生理鹽水(20 μL/只)，其余時間正常飼養。細顆粒物低劑量染毒組、中劑量染毒組、高劑量染毒組：分別于模型建立第1、8、15和22天經鼻腔滴注細顆粒物懸液1.6 mg/ kg·bw，20 μL/只； 8 mg/ kg·bw，20 μL/只；40 mg/ kg·bw，20 μL/只；中藥干預組：低劑量染毒中藥組、中劑量染毒中藥組、高劑量染毒中藥組經鼻腔滴注顆粒物劑量分別與低劑量染毒組、中劑量染毒組、高劑量染毒組相同。

干預方法：空白對照組正常飼養。細顆粒物低劑量染毒組、中劑量染毒組、高劑量染毒組第1天至第22天，經口灌服0.9%生理鹽水0.2 ml/只/d。低劑量染毒中藥組、中劑量染毒中藥組、高劑量染毒中藥組第1天至第22天，經口灌服補肺活血中藥溶液(0.82 g/kg, 0.2 ml/只/d)，各個試驗組均在最后1次染毒后48 h內處死。

2.3 取材與指標檢測

2.3.1 病理學分析 脫頸處死小鼠，開胸暴露胸腔，分離靠近肺門處的左肺上葉固定于10%甲醛溶液24 h，常規脫水石蠟包埋，切片行HE染色，光鏡下觀察。

2.3.2 免疫組化 肺組織切片常規脫蠟后，按照免疫組化試劑盒具體操作步驟進行檢測。采用美國Media Cybernetics公司生產的Image-Pro Plus圖像分析軟件進行分析，以累積光密度(Integrated Optical Density，IOD)反映蛋白表達總量。

2.3.3 ELISA檢測 取0.1 g右側肺葉組織放入1.5mlEP管中，制備成10%肺組織勻漿液，離心 4 ℃，12000 r/min，20 min取上清。按ELISA試劑盒提示的操作步驟說明進行肺組織勻漿上清液中相關炎性介質含量。

2.4 統計學方法

3 結果

3.1 中藥補肺活血膠囊對細顆粒物模型小鼠肺組織病理損傷影響

圖1顯示，HE染色后觀察小鼠肺組織，空白對照組小鼠肺組織中肺泡結構較為完整，肺泡間隔無明顯增寬，炎性細胞未見異常增多，肺泡腔及血管腔中未見明顯出血現象，肺組織內氣道結構相對完整，氣道黏膜未見明顯脫落及損傷(A1)。細顆粒物模型小鼠肺泡腔明顯變小，肺泡間隔明顯增寬(圖中藍色箭頭指示)，肺泡間隔斷裂肺泡融合明顯，肺泡內可見明顯滲出及紅細胞浸潤(圖中綠色箭頭)，肺間質可見炎性細胞浸潤，肺組織內氣管可見少量氣道黏膜上皮細胞脫落(圖中黑色箭頭指示)。且細顆粒物模型小鼠肺損傷程度可隨染毒劑量加大逐漸加重(A2、A4、A6)。經補肺活血膠囊干預后，細顆粒物模型小鼠肺泡腔較前明顯增大，肺泡間隔較染毒模型小鼠變薄，肺泡間隔內炎性細胞浸潤程度減輕；肺泡內及肺組織間隙紅細胞滲出明顯減少，氣管及終末細支氣管中氣道黏膜較為完整，未見明顯黏膜細胞脫落及氣道重塑(A3,A5,A7)。經補肺活血膠囊干預后，細顆粒物模型小鼠肺部炎性損傷及滲出明顯緩解(A1-A7)。

注：圖中藍色箭頭指示肺泡間隔明顯增寬，圖中綠色箭頭指示肺泡內可見炎性滲出及紅細胞浸潤，黑色箭頭指示肺間質炎性細胞浸潤及肺組織內氣道黏膜上皮細胞脫落圖1 各實驗組小鼠肺組織HE染色結果 (×200)

注：圖中黑色箭頭指示的褐色顆粒物為KGF表達位置。C1-C3各實驗組中KGF蛋白表達總量與染毒模型組的比較:**P<0.01，*P<0.05。C4 中各實驗組KGF蛋白表達總量差異無統計學意義圖2 各實驗小組小鼠肺組織中KGF免疫組織化學染色及KGF蛋白總量表達比較

3.2 中藥補肺活血膠囊對細顆粒物模型小鼠肺組織中 KGF表達及含量的影響

圖2顯示，角質細胞生長因子(keratinocye growth factor KGF)免疫組織化學染色后可見KGF(棕色顆粒物)主要分布于肺泡壁內側，肺泡與肺泡之間的組織間隙中有組織損傷的部位。空白對照組中，KGF主要表達于氣管壁內側，柱狀上皮細胞(B1)。肺泡結構相對完整，肺泡及肺泡間組織中未見KGF大量表達。細顆粒物模型小鼠組中模型小鼠肺泡變小，肺泡間隔增寬，肺泡間組織中KGF表達明顯增多，隨染毒劑量的增加KGF在小鼠肺組織中的表達明顯增多 (B2,B4,B6)。經補肺活血膠囊干預后小鼠肺組織中肺泡腔明顯增大，肺泡間隔變窄，肺間質中KGF的表達明顯降低(B3、B5、B7)。經補肺活血膠囊干預后小鼠肺組織結構較前明顯好轉，KGF分泌明顯降低，小鼠肺組織修復過程緩解。通過半定量檢測計算KGF在肺組織中的含量可知經補肺活血膠囊干預后肺組織中KGF蛋白表達總量明顯低于染毒組(C1-C3)，但不同染毒劑量組模型小鼠肺組織中KGF蛋白表達總量未見明顯差異(C4)。

3.3 實驗組中小鼠肺組織中IL-4、IL-17表達

表1顯示，與空白組比較細顆粒物染毒組中IL-4、IL-17在小鼠肺組織中的含量顯著增多(P)，且隨染毒劑量的增加IL-4、IL-17的表達進一步升高；經補肺活血膠囊干預后，IL-4、IL-17在肺組織中的表達明顯下降(P)。考慮經補肺活血膠囊干預后小鼠肺組織中的炎性介質表達明顯下降。

4 討論

不同粒徑顆粒物可引發不同部位的損傷，顆粒物粒徑越小進入組織的部位越深。因此，細顆粒物主要進入支氣管并深入肺部，最終可導致支氣管哮喘急性發作，誘發支氣管炎癥及肺癌等呼吸系統疾病[6]。本研究明確了經鼻腔滴注細顆粒物懸液可以成功獲得模型小鼠肺部損傷的模型，細顆粒物模型小鼠肺損傷主要表現為小氣道、肺泡及肺間質的炎性病變。IL-4是T細胞自身分泌的生長因子，會產生免疫紊亂進而導致炎癥反應的發生[7-8]。實驗結果表明，補肺活血膠囊可以降低細顆粒物模型小鼠肺組織中IL-4的分泌，考慮補肺活血膠囊可通過調節免疫機制影響炎癥反應的發生發展。IL-17是多種炎癥反應的起始因子，可促進嗜中性粒細胞和單核細胞增殖，促進炎癥募集[9]。補肺活血膠囊可有效抑制肺組織內IL-17的分泌，從而延緩細顆粒物對組織造成的炎性損傷，緩解炎癥反應過程。KGF是由γδT細胞的相關因子合成,可以刺激上皮細胞增殖、分化、遷移，以促進黏膜修復完整性的維護。相關研究表明，KGF與肺纖維化有一定相關性[12]。補肺活血膠囊通過減少KGF在肺組織中的表達，減弱肺組織損傷修復過程，降低肺組織纖維樣變可能。呼吸系統疾病多是由于炎性、炎癥損傷、損傷后修復、纖維化的一系列病理反映過程，最終影響肺組織的整體結構和功能。通過研究發現，補肺活血膠囊可通過調節關鍵炎癥因子的釋放，緩解細顆粒物所致的炎癥反應，從而減弱損傷修復所致的肺組織結構變化。

表1 各組小鼠肺組織勻漿上清液中IL-17、1 L-4含量(pg/ml)比較

注：與空白組比較:**P，*P<0.05

補肺活血膠囊由黃芪、赤芍、補骨脂組成。黃芪性甘微溫，歸脾、肺經，具有益衛固表、健脾補中之功；赤芍性苦微寒，歸肝經，具有清熱涼血、散瘀止痛之效；補骨脂性溫，歸腎、脾經，具有納氣平喘、補腎壯陽之功，故補肺活血膠囊具有補肺固腎、活血化瘀的功效。方中黃芪、補骨脂可調補肺腎，肺主氣，腎主攝納，故可使在體之氣固守于外，在內之氣固攝于內。相關臨床研究表明，補肺活血膠囊可明顯改善COPD患者的肺功能[1-3]，緩解矽肺患者肺部的炎性及氧化應激反應[10]。補肺活血膠囊中黃芪、補骨脂均可增強機體抵抗能力[11-12]，這與中醫正氣內存邪不可干的理論相吻合，與建立小鼠模型的同時給予中藥干預和中醫治未病理論相符。中醫理論認為空氣中細顆粒物即為外邪，結合顆粒物性質空氣中顆粒物為陰邪、寒濕邪，為疫戾之氣。由于外邪入侵機體出現正邪相爭，正氣盛則邪氣難以入侵，邪氣盛則為病。空氣中細顆粒物首犯機體肺衛，使氣血運行失司，因此可見痰濁瘀血停滯體內。扶助正氣是防止疾病發生發展的重要環節，補肺活血膠囊中黃芪、補骨脂均可補益正氣，赤芍則可活血通經以防痰濁瘀血內停。補肺活血膠囊在提高機體免疫力、增強機體正氣的同時，可以預防疾病的發生發展，以達到“治未病”的目的，該研究也可為防治顆粒物所致呼吸系統疾病提供新的研究思路和方向。