益腎健脾瀉濁中藥對妊娠加重慢性腎損傷大鼠的保護機制?

劉文康，馮桃花，柴亞男，郝 娟，武 寧，許慶友,2，王 箏,2△，王香婷,2△

(1. 河北中醫學院，石家莊 050091； 2. 河北省中西醫結合肝腎病證研究重點實驗室， 石家莊 050091)

慢性腎臟病(chronic kidney disease, CKD)是全球主要的公共健康問題，嚴重危害人類的身體健康。女性作為CKD的高發人群(發病率12.9%)，其妊娠面臨著重大挑戰[1]。妊娠是加重慢性腎臟病損傷的獨立危險因素[2]，不僅對母體產生損傷，還會影響新生兒質量，且相關的腎臟疾患都有不同程度的加重[3]。

在前期研究化瘀滌痰通絡中藥抑制細胞增殖的過程中，發現單側輸尿管梗阻可激活醛固酮(aldosterone，ALD)，介導炎性損傷、刺激腎臟固有細胞增殖、膠原沉積等多種病理反應，最終導致腎纖維化進展[4]。在此基礎上，本研究以“腎脾虧虛，濁毒內蘊”為病機，以妊娠合并單側輸尿管梗阻(unilateral ureteral occlusion，UUO)為動物模型，以醛固酮活化-SGK-1/NF-κB-細胞增殖-ECM積聚為途徑，給予醛固酮受體阻斷劑及益腎健脾瀉濁中藥治療，初步探討其抑制醛固酮活化、下調SGK-1/NF-κB表達、抑制細胞增殖、保護腎功能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雌性未經產Wistar大鼠90只，雄性Wistar 大鼠20只，8周齡，體質量(160±20)g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司(許可證號SCXK(京)2016-0006)。本實驗設計和方案充分考慮安全和公平的原則，研究過程中涉及的實驗動物均符合國家對醫學實驗動物的有關要求。

1.2 藥物

螺內酯片(杭州民生藥業有限公司，生產批號T18B040)。益腎健脾瀉濁方組成：黃芪 20 g，當歸 5 g，山藥 15 g，山茱萸 15 g，土茯苓 20 g，澤瀉 15 g，白芍 12 g，懷牛膝 12 g。神威藥業免煎中藥配方顆粒(生產批號17103061，17102361，17062111，17081151，17061251，17091411，17032651，17060421)，混勻煎煮15 min。

1.3 主要試劑與儀器

Cr試劑盒貝克、BUN試劑盒(曼庫爾特公司，生產批號AUZ3562，AUZ3611)；ALd試劑盒、Progesterone試劑盒、Estradiol試劑盒(天津九鼎醫學生物公司，生產批號RA21810，RG51805，RG61805)；PCNA(proteintech公司，生產批號00044915)； SGK-1、GAPDH(Affinity 公司，生產批號19U71，AB54162)；NF-kB p65 (servicebio公司生產批號181905)；免疫組化通用SP試劑盒(中杉金橋生物公司，生產批號K185910G)。γ-放射免疫計數器FJ-2021(西安二六二廠)；小型垂直電泳槽、半干轉印槽(Bio-Rad公司)；顯微照相儀、病理圖文分析系統DP72CCD，BX53顯微鏡(Olympus公司)。

1.4 模型建立及分組

雌性未經產Wistar大鼠90只，適應性喂養1周，按隨機數字表法分為假手術組(Sham)、假手術+妊娠組(SP)、UUO組(UUO)、UUO+妊娠組(UP)、UUO+妊娠+螺內酯組(SPI)、UUO+妊娠+中藥組(TCM)，每組各15只。UUO組采用UUO手術復制慢性腎病腎間質纖維化模型，水合氯醛注射麻醉，切開腹部分離左側輸尿管，于上下1/3處結扎后剪斷，縫合腹部。假手術組僅將輸尿管游離但不結扎離斷。UUO術后，SPI組大鼠給予螺內酯50 mg/kg/d灌胃[5]，TCM組大鼠給予益腎健脾瀉濁中藥3.11 g/kg/d 灌胃(結合文獻記載[6-8]，本實驗大鼠處于妊娠前后，用法用量應適度，藥物的藥力達到祛除大半病邪即可，故采用低劑量給藥)，每天1次。UUO術后第9周，對SP組、UP組、SPI組、TCM組大鼠進行陰道涂片，觀察動情周期。在動情前期及動情期，雌雄大鼠以1∶1比例進行合籠并密切觀察，發現陰栓之日確定為妊娠第1天。妊娠雌鼠稱體質量，單獨飼養。妊娠第18天將大鼠放入代謝籠，留取24 h尿。次日處死母鼠，股動脈留取全血離心取血清，摘取健側腎臟，部分置于4%多聚甲醛，部分腎組織-70 ℃保存。

1.5 指標檢測及方法

1.5.1 腎臟組織形態學改變 腎臟組織經4%多聚甲醛固定，梯度脫水、包埋，切片厚度4 μm，行HE、Masson染色。

1.5.2 各組大鼠腎功能 血清肌酐(Scr) 和尿肌酐(Ucr)采用苦味酸法測定，尿素氮(BUN)采用尿素酶-谷氨酸脫氫酶法測定，按試劑盒說明書要求進行檢測。計算內生肌酐清除率(creatinine clearance，Ccr)，內生肌酐清除率=尿肌酐×24 h尿量/血肌酐/1440。

1.5.3 各組大鼠血清醛固酮水平 放射免疫法測定血清醛固酮含量，采用液相平衡競爭放射免疫分析法。125I標記抗原(×Ag)與未標記抗原(Ag)競爭限量抗體(Ab)上的結合位點。制備樣品，配置標準品，孔內分別加入樣本、標記物、抗體，充分混勻37 ℃靜置1.5 h，加入分離劑充分混勻，4 ℃ 3600/r離心20 min，棄上清測量沉淀物cpm。計算復管靜計數的平均值進行數據處理。

1.5.4 各組大鼠妊產情況及血清孕酮、雌二醇含量 UUO術后第9周開始觀察SP組、UP組、SPI組、TCM組大鼠動情周期，合籠后記錄見陰栓情況。妊娠結束前處死母鼠，觀察大鼠見栓懷孕率、產仔數、死胎數、流產胎數，留取大鼠股動脈血，檢測血清孕酮(progesterone，P)、雌二醇(estradiol,E2)含量。

1.5.5 免疫組化檢測腎臟組織SGK-1、NF-κB、PCNA蛋白表達 采用SABC法檢測，切片，梯度脫水，抗原修復，加一抗SGK-1、NF-κB、PCNA(濃度均為1∶100)，4 ℃孵育過夜；加入二抗，PBS清洗，滴加SABC復合物，DAB顯色，蘇木精復染，脫水，透明，封片。以鏡下出現棕黃色為陽性表達。

1.5.6 Western blot 檢測腎臟SGK-1、NF-κB、PCNA的蛋白表達 將100 g腎臟組織剪碎勻漿、裂解組織蛋白、定量，20～60 μg蛋白上樣，90 V電泳2 h半干轉膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入兔抗鼠一抗SGK-1(1∶1000)、PCNA(1∶1000)、NF-κB(1∶500)，4 ℃孵育過夜，TBST清洗，羊抗兔二抗(均為1∶20000)，TBST清洗后顯影成像。以GAPDH 作為內參校正，并利用Image J系統進行定量分析，比較目的條帶/內參條帶的灰度值。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠腎臟組織形態學改變

圖1顯示，HE、Masson染色結果顯示,假手術組大鼠腎小管結構清楚，小管上皮細胞結構完整，排列整齊，間質無水腫，少量纖維成分表達。UUO造模各組大鼠腎小管擴張明顯，小管間質及細胞外基質纖維化明顯，大量炎性細胞浸潤，UP組較UUO組損傷更為嚴重。SPI組和TCM組大鼠腎臟炎性細胞浸潤及膠原沉積情況較UUO組明顯減輕。

注：擴張的腎小管；炎性細胞；膠原纖維圖1 大鼠腎臟組織HE、Masson病理改變(×400)

2.2 各組大鼠腎功能情況

表1顯示，與假手術組比較UUO各組大鼠BUN、Scr明顯升高，肌酐清除率明顯降低(P<0.01)，UP組改變更明顯；螺內酯及中藥組大鼠尿素氮、血肌酐水平有所降低(P<0.05,P<0.01)，Ccr明顯升高(P<0.01)。

表1 各組大鼠血肌酐、尿素氮、肌酐清除率

注：與sham組比較：**P<0.01；與SP組比較：▲▲P<0.01；與UUO組比較：■P<0.05，■■P<0.01； 與UP 組比較：▽▽P<0.01

2.3 各組大鼠血清醛固酮水平

表2顯示，與假手術組比較，UUO各組大鼠血清醛固酮含量顯著升高(P<0.01)；與SP 組比較，UUO組及UP組表達明顯增高(P<0.01)；SPI組及TCM組大鼠血清醛固酮含量較UP組明顯降低(P<0.01)。

表2 各組大鼠血清醛固酮、孕酮及雌二醇水平比較

注：與sham組比較：**P<0.01；與SP組比較：▲▲P<0.01；與UUO組比較：■P<0.05，■■P<0.01；與UP 組比較：▽P<0.05，▽▽P<0.01

2.4 各組大鼠妊產情況及血清孕酮、雌二醇含量

表3顯示，觀察發現SP組大鼠動情周期規律，見栓率高；UP組多數大鼠動情周期紊亂，部分甚至出現嚴重陰道炎癥，見栓率低；SPI組、TCM組部分大鼠也出現周期紊亂的現象，見栓率也相對較低。SP組大鼠見栓懷孕率高、產仔數高、不完全流產情況很少出現，平均產仔數多；UP組見栓懷孕率低，不完全流產情況嚴重，平均產仔數明顯減少；SPI組、TCM組見栓懷孕率較UP組高，大鼠產仔數較高，不完全流產情況相對減少，平均產仔數相對較多。

表3 各組大鼠妊產情況比較

注：1.見栓雌鼠是指雌雄合籠后見到陰栓的雌鼠數；2.見栓懷孕雌鼠指確定懷孕雌鼠數目，即=足月產雌鼠+不完全流產雌鼠；3.不完全流產情況是指雌鼠孕有多胎小鼠，少數仔鼠未能存活至分娩，在妊娠期間已胎停育，而大多數仔鼠能正常娩出；4.全組大鼠平均產仔數=全組所有大鼠所孕育成熟胎鼠數/見栓雌鼠；5.組內孕鼠平均產仔數=全組所有大鼠所孕育成熟胎鼠數/見栓懷孕雌鼠

表2顯示，與S組、U組比較，SP組、UP組、SPI組、TCM組大鼠血清P、E2表達水平明顯升高(P<0.05，P<0.01)；其中SP組表達水平最高，UP組表達相對較低，SPI組、TCM組P、E2水平高于UP組大鼠(P<0.05，P<0.01)。

2.5 免疫組化檢測腎臟組織SGK-1、NF-κB、PCNA蛋白表達

圖 2顯示，假手術組大鼠腎臟SGK-1、NF-κB、PCNA呈弱表達，主要見于遠端腎小管；UUO造模各組上述指標表達均明顯增強，UP組表達高于UUO組。SPI組和TCM組表達范圍及強度較UUO組均明顯減弱。

注：SGK-1、NF-κB、PCNA 在腎小管上皮細胞的表達比較假手術組大鼠腎臟SGK-1、NF-κB、PCNA呈弱表達，主要見于遠端腎小管；UUO造模各組上述指標表達均明顯增強，UP組表達高于UUO組圖2 免疫組化檢測各組大鼠腎臟組織SGK-1、NF-κB、PCNA蛋白表達(×400)

2.6 Western blot 檢測腎組織SGK-1、NF-κB、PCNA的蛋白表達

圖3顯示，與假手術組及SP組比較，UUO各組大鼠SGK-1、NF-κB、PCNA蛋白表達明顯增強(P<0.05,P<0.01)，UP組PCNA的表達高于U組(P<0.05)，螺內酯及中藥可下調其表達(P<0.05,P<0.01)。

注：與Sham組比較：#P<0.05，##P<0.01；與SP組比較：▲P<0.05，▲▲P<0.01；與UUO組比較：■P<0.05；與UP組比較:▽P<0.05，▽▽P<0.01圖3 Western blot檢測對照組及模型組大鼠腎臟SGK-1、NF-κB、PCNA蛋白表達比較

3 討論

近年來，慢性腎臟病的發病率呈升高趨勢，育齡婦女為0.1%～3%[9]。妊娠使CKD患者原有腎臟病變加重，腎小球硬化和玻璃樣變，出現重度貧血和子癇的幾率明顯增加[10-11]。有研究表明，CKD患者在妊娠晚期出現妊娠期高血壓病與腎素-血管緊張素-醛固酮系統激活密切相關[12]，其下游效應分子醛固酮作用更為重要。在腎臟損傷和妊娠的雙重作用下，RAAS系統失衡進而誘導醛固酮合成增多。活化的醛固酮可通過SGK-1/NF-κB 信號通路引起炎性損傷進而誘導細胞過度增殖[13]，增殖的細胞分泌 ECM 參與間質纖維化進展。前期研究證實，腎臟損傷可誘導醛固酮活化，通過SGK-1信號通路刺激腎小管上皮細胞增殖，參與腎纖維化進展。給予醛固酮受體阻斷劑依普利酮可抑制醛固酮活性，下調SGK-1表達進而抑制細胞增殖[14]。本研究結果顯示，UUO造模各組大鼠小管間質及細胞外基質纖維化明顯，血清醛固酮含量顯著升高，SGK-1、NF-κB、PCNA蛋白表達明顯增強，UP組表達高于UUO組，說明妊娠誘導醛固酮活化，通過SGK-1/NF-κB 信號通路引起炎性損傷，加重慢性腎病大鼠細胞增殖及纖維化。

慢性腎病合并妊娠屬于本虛標實之證，以腎脾虧虛為本，濁毒內蘊為標。慢性腎臟病，素體本虛，孕后血聚養胎，胎兒奪精傷母，脾腎虧虛更甚，脾虛

失于運化傳輸，腎虛不能氣化開闔，三焦決瀆失司，水濕內停，釀生濁毒。虛則補之，實則瀉之，以益腎健脾瀉濁為法。益腎健脾瀉濁中藥由黃芪、當歸、山藥、山茱萸、土茯苓、澤瀉、白芍、懷牛膝組成。補益氣血，扶助正氣；健脾益腎，固澀斂陰；利水除濕，瀉濁解毒。少佐懷牛膝，補益肝腎，活血通經，且補氣而不瘀滯，活血而不傷正。諸藥相伍，補中寓瀉，標本兼顧。現代研究表明，當歸的主要成分阿魏酸與黃芪組分黃芪甲苷可改善造血功能障礙，提高機體免疫力[15]。黃芪、當歸配伍，可通過減少尿蛋白，降低系膜細胞的增殖分化，緩解腎小管間質的損傷，保護足細胞裂孔膜結構的完整性，進而減少繼發性腎臟損害[16]；山藥微粉可在一定程度上提高抗氧化能力[17]。白芍主要成分白芍總苷對減少炎癥介質和炎性因子的分泌有一定作用，可有效保護腎臟功能[18]。

本研究結果表明，益腎健脾瀉濁中藥通過抑制醛固酮活化，下調SGK-1/NF-κB表達，進而抑制細胞增殖，減輕腎間質纖維化的機制，為臨床預防治療提供了理論依據。

致謝：本實驗主要在河北省中西醫結合肝腎病證研究重點實驗室完成，在此對實驗室的各位老師及同學的幫助致以衷心的感謝！)