三叉苦質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究

甘杰華， 嚴(yán) 萍?， 馬 慶， 韓正洲， 詹若挺

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源科學(xué)與工程研究中心，嶺南中藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中成藥工程技術(shù)研究中心南藥研發(fā)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510006；2.華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司，廣東深圳518002）

三叉苦 Melicope pteleifolia（Champion ex Bentham）T.G.Hartley為蕓香科蜜茱萸屬植物，又稱三丫苦、三椏苦，始載于 《嶺南采藥錄》，其性苦、寒，歸心、肝經(jīng)，有清熱解毒、祛風(fēng)除濕、消腫止痛等功效［1-2］，廣泛分布于我國(guó)廣東、廣西、海南、福建、云南等地［3-5］，在1977年版 《中國(guó)藥典》、《廣東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》 （第一冊(cè)）、 《廣西瑤族習(xí)用藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（第一卷）等標(biāo)準(zhǔn)中均有收錄［6-10］，其主要化學(xué)成分為生物堿、香豆素、揮發(fā)油、黃酮類等［10-15］。如今，三叉苦已廣泛應(yīng)用于三九胃泰、三九感冒靈等多種中成藥中，但相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)偏于簡(jiǎn)單 （僅有性狀、顯微和理化鑒別），故本實(shí)驗(yàn)對(duì)該藥材進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，以完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，具有較好的實(shí)際意義。

1 材料

1.1 儀器 KQ-700DE超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）；XR205SM-DR電子天平 （瑞士Precisa公司）；Ultimate 3000高效液相色譜儀 （美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；薄層成像系統(tǒng) （瑞士Camag公司）；Milipore-Q超純水系統(tǒng) （美國(guó)Milipore公司）。

1.2 試藥 10 cm×20 cm硅膠GF254預(yù)制薄層板（德國(guó)默克公司）。N-反式-對(duì)香豆酰酪胺 （批號(hào)wkq16031101，含有量 98%）、茵芋堿 （批號(hào)wkq16030105，含有量 98%）、白鮮堿 （批號(hào)wkq16020304，含有量98%）均購(gòu)自四川省維克奇生物科技有限公司；吳茱萸春堿 （自制，含有量＞98%）。三叉苦對(duì)照藥材 （批號(hào) 121682-201301）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；樣品藥材共20批（編號(hào)S1～S20，具體信息見表1），經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源科學(xué)與工程研究中心詹若挺研究員鑒定為蕓香科蜜茱萸屬植物三叉苦Melicope pteleifolia（Champion ex Bentham）T.G.Hartley的干燥莖。乙腈 （德國(guó)默克公司）、磷酸 （美國(guó)阿拉丁公司）為色譜純；其他試劑均為分析純；水為自制超純水。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC定性鑒別

2.1.1 供試品溶液制備 取藥材粉末5 g，加50 mL氯仿超聲提取 （40 kHz、280 W） 30 min，放冷，濾過，濾液水浴蒸干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，即得。

2.1.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取吳茱萸春堿對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.2 mg該成分的溶液，即得。

2.1.3 鑒別方法 分別吸取供試品、對(duì)照品溶液6、4 μL，點(diǎn)于同一硅膠薄層板上，置于氨蒸氣預(yù)飽和的展開缸內(nèi) （溫度25℃，相對(duì)濕度60%），以石油醚 （60～90℃） -乙酸乙酯-乙醇 （6∶3.5∶0.5）為展開劑，展開，取出，晾干，置于紫外光燈 （254 nm）下檢視，結(jié)果見圖1～2。由圖可知，供試品在對(duì)照品相應(yīng)位置處顯相同顏色斑點(diǎn)，分離度良好。

圖1 三叉苦TLC色譜圖 （Ⅰ）Fig.1 TLC chromatogram of M．pteleifolia（Ⅰ）

圖2 三叉苦TLC色譜圖 （Ⅱ）Fig.2 TLC chromatogram of M．pteleifolia（Ⅱ）

2.2 水分、浸出物、總灰分、酸不溶性灰分含有量測(cè)定 按照2015版 《中國(guó)藥典》四部方法測(cè)定，結(jié)果見表2。

2.3 N-反式-對(duì)香豆酰酪胺、茵芋堿、白鮮堿、吳茱萸春堿含有量測(cè)定

2.3.1 色譜條件 Waters Xbridge HSS T3色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流動(dòng)相乙腈-0.1% 磷酸，梯度洗脫 （0～15 min，25%乙腈；15～60 min， 25% ～40%乙腈）； 體積流量 1.0 mL／min；柱溫25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)240 nm；進(jìn)樣量10 μL。在上述色譜條件下，4種成分保留時(shí)間與對(duì)照品一致，分離度、拖尾因子符合要求，理論塔板數(shù)均達(dá)到5 000以上，色譜圖見圖3。

2.3.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取各對(duì)照品適量，加甲醇制成含N-反式-對(duì)香豆酰酪胺1.018 mg／mL、茵芋堿1.051 mg／mL、 白鮮堿1.012 mg／mL、 吳茱萸春堿1.036 mg／mL的溶液，精密量取適量置于25 mL量瓶中，甲醇定容，搖勻，即得 （含N-反式-對(duì)香豆酰酪胺0.025 45 mg／mL、 茵芋堿0.026 28 mg／mL、 白鮮堿 0.025 30 mg／mL、 吳茱萸春堿0.025 90 mg／mL）。

表2 水分、浸出物、灰分總灰分、酸不溶性灰分含有量測(cè)定結(jié)果Tab.2 Results of content determination of water， extract，total ash and acid-insoluble ash

圖3 各成分HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.3 供試品溶液制備 精密稱取藥材粉末5.0 g，置于150 mL具塞錐形瓶中，精密加入100 mL甲醇，密塞，超聲提取30 min（40 kHz、280 W），放冷，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，精密移取20 mL，水浴蒸干，甲醇溶于10 mL量瓶中并定容，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密量取 “2.3.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，甲醇按一定比例進(jìn)行稀釋，在“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo) （X），峰面積為縱坐標(biāo) （Y）進(jìn)行回歸，得N-反式-對(duì)香豆酰酪胺、茵芋堿、白鮮堿、吳茱萸春堿回歸方程分別為Y＝137.96X＋0.118 7（r＝0.999 7）、 Y＝1 081.5X＋0.950 3（r＝0.999 8）、Y＝1 775.1X－1.335 8 （r＝0.999 8）、 Y＝1 586.2X＋1.193 （r＝0.999 8）， 分別在 0.002 036～0.203 6、0.002 102～0.210 2、 0.002 024～0.202 4、0.002 072～0.207 2 mg／mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 取S10樣品，按 “2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在 “2.3.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得N-反式-對(duì)香豆酰酪胺、茵芋堿、白鮮堿、吳茱萸春堿峰面積RSD分別為1.71%、1.83%、1.81%、0.47%，表明儀器精密度良好。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取S10樣品，按 “2.3.3”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，在 “2.3.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得N-反式-對(duì)香豆酰酪胺、茵芋堿、白鮮堿、吳茱萸春堿含有量RSD分別為1.91%%、1.60%、1.83%、0.68%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取 “2.3.6”下供試品溶液，在 “2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下于 0、 2、 4、 8、 12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得N-反式-對(duì)香豆酰酪胺、茵芋堿、白鮮堿、吳茱萸春堿峰面積 RSD分別為1.34%、1.26%、1.84%、0.49%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn) 取含有量已知的S10樣品，分別精密稱取2.0、2.5、3.0 g，各3份，精密加入甲醇溶解的對(duì)照品溶液100 mL（按藥材原有量的100%加入對(duì)照品），在 “2.3.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表3。

表3 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 （n＝9）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n＝9）

2.3.9 樣品含有量測(cè)定 取S1～S20樣品，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行2份，在 “2.3.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含有量，結(jié)果見表4。

3 討論

3.1 TLC耐用性考察 本實(shí)驗(yàn)考察了TLC法在低溫 （4℃）、常溫 （25℃）、低濕 （32%）、高濕（88%），以及不同廠家薄層板條件下的耐用性。結(jié)果顯示，該方法在不同溫度、濕度條件下斑點(diǎn)清晰，分離度良好；在不同廠家薄層板上均有良好分離效果，以德國(guó)默克公司生產(chǎn)者最優(yōu)。

表4 各成分含有量測(cè)定結(jié)果Tab.4 Results of content determination of various constituents

3.2 供試品提取方法和色譜條件考察 本實(shí)驗(yàn)考察了水、50%乙醇、乙醇、50%甲醇、甲醇，以及超聲、回流提取15、30、45 min對(duì)三叉苦提取效果的影響，發(fā)現(xiàn)甲醇超聲30 min時(shí)提取完全，而且操作簡(jiǎn)單。考察檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)，選擇藥材中含有量較高的生物堿作為對(duì)象，DAD檢測(cè)器在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)各成分最大吸收波長(zhǎng)分別為吳茱萸春堿244 nm、白鮮堿237 nm、茵芋堿 248 nm、N-反式-對(duì)香豆酰酪胺290 nm，綜合考慮，選擇240 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。考察流動(dòng)相時(shí)，選擇甲醇-磷酸、乙腈-磷酸、甲醇-甲酸、乙腈-甲酸，以及0.05%、0.1%、0.2%磷酸、甲酸，發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.1%磷酸為流動(dòng)相時(shí)分離效果良好，干擾成分少。考察色譜柱適用性時(shí)，選擇Ecoil HPLC C18（4.6 mm×250 mm， 5 μm）、 Waters Xselect HSS T3 （4.6 mm×250 mm， 5 μm）、CAPCELL PAK MGII C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.1%磷酸為流動(dòng)相時(shí)三者均可達(dá)到良好分離效果。

3.3 限量指標(biāo)確定 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，20批三叉苦中N-反式-對(duì)香豆酰酪胺、茵芋堿、白鮮堿、吳茱萸春堿含有量差異較大，平均值分別為0.018 0%、0.010 1%、0.010 6%、0.020 8%，即以吳茱萸春堿含有量最高。為了便于控制藥材質(zhì)量，選擇吳茱萸春堿作為限量指標(biāo)，并建議其含有量不得低于0.015% （按干燥品計(jì)算）。

3.4 水分、灰分、酸不溶性灰分、浸出物限度確定 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，20批三叉苦中水分、總灰分、酸不溶性灰分平均含有量分別為5.84%、1.12%、0.06%，并建議三者分別不得超過8.0%、1.5%、0.1%。再考察水、稀乙醇、95%乙醇，以及冷浸法、熱浸法對(duì)浸出物含有量的影響，發(fā)現(xiàn)稀乙醇提取效果最好，冷浸法、熱浸法無明顯差異，浸出物（冷浸法）平均含有量為5.05%，并建議其不得低于4.0%。