不同產地香薷HPLC指紋圖譜的建立及7種成分測定

張依欣， 凡若楠， 張崇佩， 龔千鋒， 鐘凌云， 于 歡

（江西中醫藥大學藥學院，江西南昌330004）

香薷，又名香葇、香茹，為江西省道地藥材，其入藥始見于 《名醫別錄》，古人治暑病，常以香薷飲為首藥，是唇形科植物石香薷Mosla chinensis Maxim或江香薷Mosla chinensis‘Jiangxiangru’的干燥地上部分［1］。主要功效為發汗而解表，化濕和中而解暑，開宣肺氣而利水消腫［2］。香薷作為全草入藥，臨床上主要用于治療暑濕感冒、惡寒發熱、頭痛無汗、水腫、腹痛吐瀉。香薷中的活性成分主 要為 揮發 油 類［3-5］、 黃 酮 類［6-9］、 多 糖 類等［10-11］，現代研究表明香薷中黃酮類是其發揮抗菌抗炎癥作用的主要成分之一［12-13］。現對不同產地不同批次的香薷飲片及鮮品建立HPLC指紋圖譜，并測定7種黃酮類成分的含有量，以期對香薷質量控制及道地藥材考證提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Ultimate 3000型高效液相色譜儀 （美國Dionex公司，配置PDA-3000型二極管陣列紫外檢測器和Chromeleon工作站）；AE240電子分析天平 （十萬分之一，梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；GZX-9076MBE電熱鼓風干燥箱（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）；SHZ-D（Ⅲ）循環水式真空泵 （鞏義市英峪予華儀器廠）；中藥粉碎機（長沙旭朗粉碎機械有限公司）；3號標準篩 （紹興市上虞張興紗篩廠）；KQ-5200B超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；水相和有機相過濾膜 （上海市新亞凈化器件廠）。

1.2 藥材與試劑 分析純磷酸 （國藥集團化學試劑有限公司）；色譜純乙腈、甲醇、分析純乙醇（西隴科學股份有限公司）；水為娃哈哈純凈水。咖啡酸 （批號BCTG-0286，江西本草天工生物技術有限公司）；蘆丁 （批號100080-200707，中國食品藥品檢定研究院）；芹菜苷 （批號BCTG-0208，江西本草天工生物技術有限公司）；木犀草苷 （批號BCTG-0278，江西本草天工生物技術有限公司）；木犀草素 （批號BCTG-0209，江西本草天工生物技術有限公司）；芹菜素 （批號BCTG-0257，江西本草天工生物技術有限公司）；黃芩素-7-甲醚 （批號20560-201610，南昌貝塔生物科技有限公司）。

香薷藥材于2017年間在醫藥公司與藥材市場收購的飲片及江西新余市分宜縣采收的江香薷鮮品12個不同批次，經江西中醫藥大學張壽文教授鑒定為正品，見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結果

2.1 對照品溶液制備 精密稱取咖啡酸395.00 μg、 蘆丁 530.00 μg、 芹菜苷 784.00 μg、木犀草苷 535.00 μg、 木犀草素 541.00 μg、 芹菜素 406.00 μg、 黃 芩 素-7-甲 醚 400.00 μg 置 于25 mL量瓶中，加甲醇定容，分別配制成質量濃度為 158.00、 212.00、 313.60、 216.40、 214.00、162.40、 160.00 μg／mL 的對照品溶液。

2.2 供試品溶液制備

2.2.1 鮮品前處理 將新鮮采摘的香薷藥材搶水洗凈，后放置陰涼通風處陰干，剪成1～2 cm短段，備用。

2.2.2 供試品溶液制備 精密稱取香薷藥材2.000 g，加入20 mL 95%乙醇浸泡1 h后超聲（200 W，40 kHZ）45 min，過濾，取續濾液，0.22 μm微孔濾膜過濾。

2.3 色譜條件 Diamosil C18色譜柱 （250 nm×4.6 nm，5 μm）； 乙腈流動相 （A） -0.2% 磷酸（B），梯度洗脫，程序見表2；檢測波長210 nm；體積流量1.0 mL／min；柱溫30℃；進樣量10 μL。在此色譜條件下，7種成分得到很好的分離，保留時間與對照品一致。

表2 梯度洗脫程序Tab.2 Gradient elution programs

2.4 方法學考察

2.4.1 系統適應性試驗 取 “2.1”項下對照品溶液，在 “2.3”項色譜條件下進樣，記錄色譜圖，見圖1。

圖1 黃芩素-7-甲醚對照品HPLC圖譜Fig.1 HPLC reference spectrum of 5，6-dihydroxy-7-methoxyflavone

2.4.2 線性關系考察 精密吸取 “2.1”項下對照品溶液適量至5 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，配制不同質量濃度的對照品溶液，在 “2.3”項色譜條件下進樣，以峰面積為縱坐標 （Y），各對照品質量濃度為橫坐標 （X）進行回歸，結果見表3。素-7-甲醚各主要共有峰相對保留時間和峰面積RSD＜2.82%，表明該方法重復性良好。

2.4.5 穩定性試驗 取同一供試品 （S1）溶液，在 “2.3” 項色譜條件下， 分別于0、2、4、6、8、12 h進樣，測得咖啡酸、蘆丁、芹菜苷、木犀草苷、木犀草素、芹菜素、黃芩素-7-甲醚各主要共有峰相對保留時間和峰面積RSD＜2.82%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗 精密稱取6份已知含有量的S1香薷供試品1.000 g，分別加入高、中、低3種不同質量濃度的7種對照品，加入20 mL 95%乙醇，按 “2.2”項下方法制備質量濃度減半的供試品溶液，在 “2.3”項色譜條件下進樣，計算加樣回收率，見表4。

2.4.7 樣品含有量測定 取香薷樣品，按 “2.2”項下方法制成供試品溶液，在 “2.3”項色譜條件下進樣，測定含有量，結果見表5。

可知，天齊堂飲片公司的香薷藥材 （S1）均含有此7種成分，且芹菜苷與黃芩素-7-甲醚在所有批次中均能檢測到，由于黃芩素-7-甲醚的含有量相對最高，便于指認，因此指紋圖譜主要以S1中黃芩素-7-甲醚為參照峰。

2.5 指紋圖譜建立及分析

2.5.1 指紋圖譜建立 稱取藥材粉末約2.000 g，

表3 各成分線性關系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.4.3 精密度試驗 精密吸取 “2.2”項下同一供試品溶液 （S1）適量，0.22 μm微孔濾膜過濾，在 “2.3”項色譜條件下連續進樣6次，測得咖啡酸、蘆丁、芹菜苷、木犀草苷、木犀草素、芹菜素、黃芩素-7-甲醚各主要共有峰相對保留時間和峰面積RSD＜2.75%，表明該方法精密度良好。

2.4.4 重復性試驗 平行稱取6份同一樣品（S1），按 “2.2”項下方法制備6份供試品溶液，在 “2.3”項色譜條件下進樣，測得咖啡酸、蘆丁、芹菜苷、木犀草苷、木犀草素、芹菜素、黃芩

按 “2.2”項下方法制備供試品溶液，在 “2.3”項色譜條件下進樣，記錄60 min色譜圖，見圖2。

表4 各成分加樣回收率試驗結果 （n＝6）Tab.4 Results of recovery tests for various constituents （n＝6）

表5 各成分含有量測定結果 （mg）Tab.5 Results of content determination of various constituents （mg）

圖2 香薷HPLC對照圖譜Fig.1 HPLC reference spectrum of M．chinensis

2.5.2 共有指紋峰標定 將12批次樣品HPLC指紋圖譜導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004A版），以S1號批次香薷藥材為參照圖譜，以平均數法、時間窗寬度0.1生成對照圖譜。詳細比較了所有批次樣品的HPLC色譜圖，共確定了14個特征共有峰，其中2號峰為咖啡酸、4號峰為蘆丁、5號峰為芹菜苷、6號峰為木犀草苷、7號峰為木犀草素、9號峰為芹菜素、10號峰為黃芩素-7-甲醚。以10號峰為參照峰，計算各色譜峰保留時間和保留峰面積與同一圖譜中10號峰的保留時間和保留峰面積比值，共有峰相對保留時間的RSD值較小，而相對峰面積的RSD值較大，表明不同產地香薷的指紋圖譜中主要峰出峰時間接近，整體圖貌基本一致，但各個產地以及飲片、鮮品中含有量差別較大。

2.5.3 參照峰選擇 通過觀察色譜圖，發現10號峰峰面積較大，出峰時間適宜，其分離度較好且含有量較穩定 （8號、13號、14號峰的出峰時間也適宜，但是個別峰不及10號峰穩定性高，且10號峰為已知峰），故選擇該峰作為參照峰 （S）建立香薷藥材HPLC指紋圖譜的共有模式，見圖3。

圖3 12批樣品HPLC指紋圖譜Fig.3 HPLC fingerprints of twelve batches of samples

2.5.4 相似度分析 將12批不同香薷藥材HPLC指紋圖譜導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004A版）中以對照指紋圖譜進行相似度評價，結果見表6，各批次間相似度均在0.96以上，表明不同批次間相似度良好。

表6 12批樣品相似度Tab.6 Similarities of twelve batches of samples

3 討論與結論

3.1 樣品處理方法考察 根據2015版 《中國藥典》［14］中對香薷的記載，香薷的主要成分為揮發油類，采用水蒸氣蒸餾法進行提取，但揮發油類成分易揮發，穩定性較差，使用黃酮類作為香薷藥材指紋圖譜考察主要因素更為適宜。該成分提取方法多為超聲輔助提取和回流提取［15-18］，本實驗采用正交設計，優選出香薷黃酮最佳提取工藝為溶于95%乙醇，浸泡1 h，超聲45 min，方法簡便，時間短，提取效率高。

3.2 色譜條件考察［19］本實驗考察了甲醇-磷酸水溶液、甲醇-冰醋酸水溶液、乙腈-冰醋酸水溶液等洗脫系統，以指標成分色譜峰作為參考指標，發現當流動相為乙腈-0.2%磷酸水時分離程度最佳，且保留時間符合要求。

本實驗選取不同產地12批樣品，前期采用TLC技術初步定性，大致確定香薷藥材中含有咖啡酸、蘆丁、芹菜苷、木犀草苷、木犀草素、芹菜素、山柰酚、黃芩素-7-甲醚等成分，因此建立了8種成分的HPLC指紋圖譜，但由于山柰酚含有量極低，難以準確定量，故最終以7種成分作為檢識指標。本實驗尚存在鮮品數量較少、飲片與鮮品對比不夠顯著的不足，亟待進一步研究分析。