白芍經皮透過液對小鼠皮膚成纖維細胞損傷模型的影響

付遠飛， 劉惠婷， 郭宏雅， 王 劍

（廣州中醫藥大學基礎醫學院，廣東廣州510006）

皮膚衰老與成纖維細胞數量減少、分泌合成膠原蛋白功能降低或異常有關。白芍為毛茛科植物芍藥Paeonia lactiflora Pall.的干燥根，具有養血平肝、斂陰止汗等功效，其味甘、酸，性微寒，具有養血美容之功效［1-2］。本實驗以D-半乳糖誘導小鼠皮膚成纖維細胞建立細胞損傷模型，經Franz擴散池透皮處理得到的白芍經皮透過液作用于模型細胞，研究其對該模型的影響，以期探討白芍抗衰老作用。

1 材料

1.1 藥材 白芍購自廣州市藥材公司中藥飲片廠，批號YPA5I0003，經廣州中醫藥大學王劍教授鑒定為毛茛科植物芍藥Paeonia lactiflora Pall.的干燥根。

1.2 細胞 小鼠皮膚成纖維細胞從新生昆明小鼠軀干皮膚體外分離培養。

1.3 動物 昆明種小鼠30只，雌雄兼有，體質量 （22±2）g，購自廣州中醫藥大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號SCXK（粵2013-0020）5只雌鼠與10只雄鼠合籠飼養，其余15只雌鼠合籠飼養。

1.4 試劑 DMEM培養基、胎牛血清、0.25%胰酶 （美國Gibco公司）；PBS（江蘇恩莫阿賽生物技術有限公司）；維生素E（美國Sigma公司）；D-半乳糖 （廣州威佳科技有限公司）；CCK-8試劑盒 （日本Dojindo公司）；β-半乳糖苷酶染色試劑盒 （上海碧云天生物技術有限公司）；Annexin-V／PI（美國 BioLegend 公司）； PI（美國 Nexcelom Bioscience公司）。

1.5 儀器 SW-CJ-2F雙人單面垂直凈化工作臺 （上海博迅醫療生物儀器股份有限公司）；Galaxy S二氧化碳培養箱（德國Eppendorf公司）；XSZ-D2倒置生物顯微鏡 （重慶光學儀器廠）；GL-21 M離心機 （上海盧湘儀離心機儀器有限公司）；打粉機 （瑞安市永歷制藥機械有限公司）、LABOROTA 4000旋轉蒸發儀 （德國 Heidolph公司）、SHZ-D（Ⅲ）循環水式真空泵 （鞏義市予華儀器有限責任公司）；YB-P6智能透皮儀 （天津藥典標準儀器廠）；冰點滲透壓測定儀 （德國Gonnotec公司）；TC-15恒溫水浴鍋 （海寧市新華醫療器械廠）；WX-2300高精度多功能酶標儀 （西安唯信機電設備有限公司）；IX71倒置熒光顯微鏡 （日本O-lympus公司）；FACSJazz流式細胞儀 （美國BD公司）。

2 方法

2.1 小鼠皮膚成纖維細胞制備 采用組織塊培養法。取同一母鼠的同一胎幼鼠，共8只，出生2～3 d后頸椎脫臼處死，75%乙醇浸泡10 min，超凈臺內分離軀干部皮膚，75%乙醇再次浸泡消毒后剪成小塊，PBS緩沖液漂洗去除血液，均勻轉移至細胞培養瓶中，平鋪于瓶內，底面朝上倒置5 min后翻轉平放，加DMEM完全培養基使其剛好浸沒組織塊，置于恒溫培養箱中充分培養，24 h后觀察組織塊是否牢固平貼于瓶底，待其穩固貼牢后加入適量DMEM完全培養基，每2 d更換1次，8～10 d后細胞鋪滿瓶底，消化傳代。

2.2 細胞傳代、純化 鏡下觀察細胞生長，長滿培養瓶瓶底70%～80%時即可用于傳代，PBS沖洗細胞后棄去PBS，重復1次，胰酶消化，移入離心管，離心后棄上清液，加DMEM完全培養基吹打細胞，吹打混勻后按1∶3的比例傳代培養，約每3 d傳代1次。同時，通過差速貼壁法純化小鼠皮膚成纖維細胞，穩定傳3～6代后即可用于實驗。

2.3 白芍經皮透過液制備 取20 g白芍打成粗粉，加入200 mL 70%乙醇浸泡1 h，微波提取30 min，重復1次，合并2次提取液，過濾，濾液減壓濃縮后離心取上清液，作為濃縮液。取雌鼠15只，頸椎脫臼處死，剪取腹部皮膚，刮毛并除去脂肪，角質層向下平整鋪放在提前準備好的培養皿內，生理鹽水反復沖洗至無血色后，修剪其大小為略大于擴散池面積，固定在Franz擴散池的接受池與給藥池之間，接受池中加入40%乙醇作為接受介質，給藥池中加入濃縮液6 m，再將 Franz擴散池放置在智能透皮儀中（37℃、150 r／min），24 h后收集接受池內透過液，減壓濃縮至干，加6 mL培養基復溶，即得。冰點滲透壓測定儀測得滲透壓與生理鹽水相當時，過濾除菌備用。

2.4 細胞培養、分組、給藥 取處于對數生長期的小鼠皮膚成纖維細胞，以1×105／mL細胞密度分別接種于6、96孔板中，37℃、5%CO2恒溫培養箱中培養24 h后棄去培養基，正常組加入完全培養基，模型組加入含0.25 mol／L D-半乳糖的完全培養基，陽性對照組加入含0.25 mol／L D-半乳糖、0.05%維生素E的完全培養基，白芍經皮透過液分 別 加 入 含 0.25 mol／L D-半 乳 糖 2、 10、 20、 100、200 mg／mL白芍經皮透過液的完全培養基，每組設6個復孔，放入培養箱中培養24 h。

2.5 細胞活性檢測 采用CCK-8法。取 “2.4”項下96孔板，恒溫培養箱中培養48 h后加入CCK-8溶液10 μL，放置培養箱中2 h后取出，酶標儀于450 nm波長處測定其吸光度。

2.6 細胞衰老檢測 采用 β-半乳糖苷酶染色法。取“2.4”項下96孔板，棄去培養基，PBS沖洗1次，棄去PBS，每孔加入65 μL β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫下固定，15 min后吸棄固定液，PBS沖洗3 min，重復2次，吸棄PBS，每孔加65 μL工作液，37℃孵育過夜，置于光學顯微鏡下觀察，細胞質染成藍綠色的為衰老細胞，鏡下視野選取200個細胞，計算細胞衰老率。

2.7 細胞周期檢測 采用流式細胞術法。取 “2.4”項下的6孔板，0.25%胰酶消化，收集細胞，調整細胞密度為1×105／mL，70%預冷乙醇固定、PI染色，應用流式細胞儀分析細胞周期。

2.8 細胞凋亡檢測 取 “2.4”項下6孔板，加入預冷PBS沖洗細胞，吸棄PBS，加入適量結合緩沖液重懸細胞（密度1×105／mL）， 細胞懸液中加入 Annexin-V／PI工作液孵育，過篩網后用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

2.9 統計學分析 通過SPSS 20.0軟件進行處理，數據以（±s）表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，兩組間均數比較采用Dunnett-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 白芍經皮透過液對小鼠皮膚成纖維細胞活性的影響 表1顯示，與正常組比較，模型組細胞活性明顯降低（P＜0.01），表明造模成功；與模型組比較，白芍經皮透過液組其活性顯著升高 （P＜0.05），在20 mg／mL時更明顯；與陽性對照組比較，白芍經皮透過液10、20、100 mg／mL組其活性也顯著升高 （P＜0.05）。

表1 對小鼠皮膚成纖維細胞活性的影響 （±s， n＝6）

表1 對小鼠皮膚成纖維細胞活性的影響 （±s， n＝6）

注：與正常組比較，??P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05；與陽性對照組比較，△P＜0.05

組別 劑量／（mg·mL－1） 吸光度正常組 — 0.795±0.019模型組 — 0.392±0.201??陽性對照組 — 0.588±0.019＃白芍經皮透過液組 2 0.592±0.020＃白芍經皮透過液組 10 0.661±0.032＃△白芍經皮透過液組 20 0.768±0.019＃△白芍經皮透過液組 100 0.691±0.032＃△白芍經皮透過液組 200 0.587±0.012＃

3.2 白芍經皮透過液對小鼠皮膚成纖維細胞β-半乳糖苷酶活性的影響 圖1、表2顯示，正常組僅有少量細胞β-半乳糖苷酶染色陽性，細胞衰老率低；與正常組比較，模型組β-半乳糖苷酶染色陽性細胞明顯增加，細胞衰老率顯著上升 （P＜0.01），表明造模成功；與模型組比較，陽性對照組、白芍經皮透過液組細胞衰老率顯著下降 （P＜0.05），其中20 mg／mL組顯著低于陽性對照組 （P＜0.05）。

表2 對小鼠皮膚成纖維細胞衰老率的影響 （±s， n＝6）

表2 對小鼠皮膚成纖維細胞衰老率的影響 （±s， n＝6）

注：與正常組比較，??P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05；與陽性對照組比較，△P＜0.05

組別 劑量／（mg·mL－1） 細胞衰老率／%正常組 — 19.65±0.021模型組 — 66.76±0.022??陽性對照組 — 58.73±0.035＃白芍經皮透過液組 2 61.11±0.031＃白芍經皮透過液組 10 53.78±0.029＃白芍經皮透過液組 20 51.09±0.040＃△白芍經皮透過液組 100 59.19±0.032＃白芍經皮透過液組 200 60.96±0.043＃

3.3 白芍經皮透過液對小鼠皮膚成纖維細胞周期的影響 表3顯示，與正常組比較，模型組G0／G1期生長顯著抑制 （P＜0.01）；與模型組比較，白芍經皮透過液組G0／G1期細胞比例顯著升高 （P＜0.05），并與陽性對照組比較無顯著差異 （P＞0.05）。另外，與正常組比較，模型組S期細胞比例顯著降低 （P＜0.01）；與模型組比較，白芍經皮透過液組其比例顯著升高 （P＜0.05），細胞DNA合成增加；與陽性對照組比較，白芍經皮透過液 10、20、100 mg／mL組其比例也顯著升高 （P＜0.05， P＜0.01）， 以20 mg／mL組更明顯。但各組G2／M比例均無明顯變化 （P＞0.05）。

3.4 白芍經皮透過液對小鼠皮膚成纖維細胞凋亡的影響 表4顯示，與正常組比較，模型組細胞凋亡率顯著升高 （P＜0.01）；與模型組比較，白芍經皮透過液組其凋亡率顯著降低 （P＜0.05）；與陽性對照組比較，白芍經皮透過液10、 20、 100 mg／mL 組顯著降低 （P＜0.05）。

圖1 對小鼠皮膚成纖維細胞β-半乳糖苷酶活性的影響 （×100）（n＝6）

表3 對小鼠皮膚成纖維細胞周期的影響 （±s， n＝6）

表3 對小鼠皮膚成纖維細胞周期的影響 （±s， n＝6）

注：與正常組比較，??P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05；與陽性對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別 劑量／（mg·mL－1）（G0／G1） ／% S／% （G2／M）／%正常組 — 89.62±0.21 6.03±0.17 4.35±0.11模型組 — 92.07±0.35?? 3.69±0.12?? 4.24±0.08陽性對照組 — 91.13±0.11＃ 5.04±0.20＃ 3.83±0.14白芍經皮透過液組 2 91.15±0.26＃ 5.01±0.10＃ 3.84±0.14白芍經皮透過液組 10 91.04±0.13＃ 5.60±0.11＃△ 3.36±0.11白芍經皮透過液組 20 90.74±0.09＃ 5.94±0.20＃△△3.32±0.18白芍經皮透過液組 100 91.09±0.17＃ 5.51±0.13＃△ 3.40±0.11白芍經皮透過液組 200 91.25±0.26＃ 4.91±0.11＃ 3.84±0.14

表4 對小鼠皮膚成纖維細胞凋亡的影響 （±s， n＝6）

表4 對小鼠皮膚成纖維細胞凋亡的影響 （±s， n＝6）

注：與正常組比較，??P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05；與陽性對照組比較，△P＜0.05

組別 劑量／（mg·mL－1） 細胞凋亡率／%正常組 — 5.01±0.10模型組 — 43.39±0.16??陽性對照組 — 24.99±0.20＃白芍經皮透過液組 2 25.01±0.09＃白芍經皮透過液組 10 17.06±0.14＃△白芍經皮透過液組 20 9.15±0.11＃△白芍經皮透過液組 100 18.66±0.12＃△白芍經皮透過液組 200 25.14±0.09＃

4 討論

白芍為養血柔肝、斂陰止痛之要藥，其有效成分主要為白芍總苷，具有止痛、抗炎、調節免疫等作用，廣泛用于治療各種皮膚病［3］，而且具有抗氧化活性［4］，而且從白芍中提取出的五沒子酰基葡萄糖也具有相同作用［5］。但白芍提取液中有效成分的口服生物利用度較低［6-7］，從而限制了相關應用，而且在含白芍的局部外用制劑中缺少透皮藥液研究，故本實驗將白芍經皮透過液作用于損傷細胞以探究白芍抗衰老作用。白芍提取液經過透皮處理后，能充分模擬藥物透皮吸收過程，與白芍提取液相比能顯著提高藥效，更能代表藥物生物利用度，為中醫藥應用于皮膚抗衰老外用制劑的研發提供新思路。

皮膚成纖維細胞作為皮膚真皮中的主要細胞組成，其生物學特性變化可作為皮膚老化的決定性因素。本實驗選用D-半乳糖誘導小鼠皮膚成纖維細胞損傷模型［8］，它作用于細胞時可使細胞內半乳糖含有量升高，醛糖還原酶催化還原，以半乳糖醇形式存在，使細胞代謝失常，進而導致衰老［9-10］。

β-半乳糖苷酶作為細胞衰老的標志酶，對其進行染色試驗可用于判斷細胞衰老狀況［11］。本實驗發現，不同質量濃度白芍經皮透過液可減少β-半乳糖苷酶染色陽性細胞，降低細胞衰老率，而且在20 mg／mL時效果最強。另外，白芍經皮透過液在高質量濃度下并未呈現出更明顯的作用，可能是由于高質量濃度時滲透性物質過多，從而對正常生理狀態下的細胞會造成非特異性影響。

細胞周期變化可反映細胞增殖情況［12］，G0／G1期細胞比例上升，S期細胞比例下降，表明細胞生長受到阻滯，增殖能力減弱，細胞出現損傷甚至衰老。本實驗發現，白芍經皮透過液可使細胞G0／G1期比例降低，S期比例升高，而S期為DNA合成期，推測白芍對小鼠皮膚成纖維細胞的作用機制可能是通過促進G0／G1期細胞向S期轉變，增加細胞DNA合成，從而加速細胞增殖。

綜上所述，白芍經皮透過液可通過對細胞活力和細胞周期的作用來增強細胞增殖能力，改善D-半乳糖誘導的小鼠皮膚成纖維細胞損傷，對其具有保護作用，提示白芍可用于皮膚抗衰老產品的開發。但白芍經皮透過液中的主要有效成分尚不明確，有待于進一步研究。