茶白星病不同病情等級下葉際細菌群落多樣性與功能預測

周凌云，向 芬，劉紅艷，李 維，周 琳，銀 霞，曾澤萱，王振中

（1.湖南省農業科學院 茶葉研究所，湖南 長沙 410125；2.華南農業大學 農學院，廣東 廣州 510642）

茶白星病屬于高海拔茶區常發葉部病害之一。該病一般在春茶萌芽初始發生，最初在茶園的嫩芽及嫩葉上出現針頭大褐色小點，后逐漸擴大成直徑0.3～2.0 mm的圓形病斑。整個茶園葉片上布滿紅褐色圓形斑點，病斑后期直徑最大至2.0 mm、病緣紫黑色、中央灰白色形似鳥眼狀。茶白星病發病高峰期與春茶采摘期基本一致，而且春季相對降雨量較大，不利于茶白星病的化學防控[1]。病害發生與環境、寄主關系密切，高海拔茶區的葉際微生物環境是病害發生的重要影響因素，茶白星病的發生程度與環境各項因子均有相關性[2-3]。在微觀茶葉表面往往有茶葉自身分泌的兒茶酚等對多種病原菌有抑制作用的物質，抑制真菌孢子萌發，甚至導致孢子破裂[4]。

葉際作為茶樹主要微生物棲息地，葉際微生物之間的互作影響植株的健康與生長，以及農作物的產量[5-6]。目前葉際群落的研究主要集中在可培養的物種或者病原菌以及與植物寄主互作相關的有益微生物上[7-8]。然而，目前自然環境中只有少數微生物可以被人工培養。由于高通量測序技術不再局限于可培養微生物的研究，因此近年來高通量測序技術的發展促進了擬南芥[9]、水稻[10]和菠菜[11-12]等作物葉際微生物組成和結構的深入研究。尤其在環境[13-15]、基因型[16]、海拔[17]、季節[18]等生物和非生物因素共同調控植物葉際微生物的群落結構。茶葉根際土壤微生物通過16 SrRNA、PCR-變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE），明確其最大影響因子為土壤PH值[19]與液體[20]。在農業生態系統中很少有運用高通量測序技術研究作物—葉際生物—病原菌相互作用的報導，目前開始逐漸應用這種高通量測序測定的微生物群落來分析生物脅迫情況[6]，如測序顯示南瓜白粉病菌改變了南瓜葉際細菌群落結構，影響細菌群落多樣性[21]。

本文通過Miseq 2×3006p宏基因組測序平臺擴增3個茶白星病病情等級下細菌的V3～V4區，全面評估茶白星病引致的葉際細菌群落多樣性及類群組成，篩選出與茶白星病發生相關的細菌，比較分析葉際微生物和病原菌的相互作用，以期為茶白星病的生物防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和采樣地點

供試樣品采自湖南石門縣東山峰茶葉基地的福鼎大白茶，采集時間為2018年4月25日下午，正值茶白星病田間發生病情上升期間。試驗根據茶白星病斑面積占整個葉面積比例設為3個處理，每個處理分別對應一個病情等級。BCK：無病斑（空白對照）；B2：2級，病斑面積占整個葉面積的11%～50%；B4：4級，病斑面積占整個葉面積的80%以上。根據發病程度各采集3張葉片。

1.2 DNA提取、擴增和測序

稱取6 g葉片于100 mL的磷酸緩沖溶液（pH7.0，0.1 mol/L）中，再加入100 uL吐溫80。超聲波震蕩8 min后在25℃條件下以200 r/min的轉速在搖床中震蕩30 min，接著用超聲波震蕩2 min。使用0.45 μm濾膜收集細菌，采取液氮研磨的方法將樣品磨成粉末狀，應用細菌基因組DNA提取試劑盒（北京天根）抽提DNA。以此DNA為模板，并應用16SrRNA基因的通用341F引物CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG及805R引物：GACTGGAGTTCCTTGGCAC CCGAGAATTCCA[22]對樣品進行PCR擴增。50 μLPCR反應體系：5 μL10×PCRbuffer（ 含20 mMMgC12），1.5 μLdNTP（10 mM），1 UTaqDNA聚合酶，1 uLDNA模板，加滅菌ddH2O補至50 μL。PCR反應程序：94℃預變性1 min；94℃變性20 s，56℃退火25 s，72℃延伸40 s；循環35次；最后72℃延伸10 min，4℃保存。PCR擴增產物用l.2%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，純化后送公司進行高通量測序。

1.3 序列數據處理與統計分析

首先使用FastQC評估原始數據的質量指標，去除未識別堿基和低質量序列。計算DNA矩陣，調用UPARSE程序，在最佳的similarity值下對序列進行 OTU （Operational Taxonomic Units）分類單元劃分。應用VENN圖可以用來統計樣本中共有的和獨有的OTU數目，再使用非加權組平均法UPGMA （Unweighted pair group method with arithmetic mean） 算法構建樹狀結構，同時基于各樣本物種豐度通過Bray-Curtis算法構建的樣本聚類樹與物種豐度柱狀圖結合起來，RDP-Classifer軟件分析設置置信度參數為50%。對數據進行均一化處理，計算不同分類等級上的OTU的數量和Chaol，繪制稀釋曲線。使用去趨勢對應分析（Detrended Correspondence Analsis，DCA）以及非參數檢驗方法Adonis來分析不同等級之間的細菌群落結構差異。并基于PICRUSt功能二級分類結果，比較樣本或組間豐度差異，找出樣本豐度存在差異的功能分類，默認篩選條件為P≤0.05。

2 結果與分析

2.1 茶葉葉際細菌群落基本組成和結構

原始數據經過處理后共獲得111335條高質量序列片段，平均為37112條，見表1；在97%的相似水平下的OTU進行生物信息統計分析，見圖1。其中檢測到1925個OTUs，隨著病情等級提高，OTU的相對豐度與病情等級呈正相關。BCK、B2和B4中特異OTU分別占33.75%、53.32%和59.29%，所有的樣品中共檢測到166個重合OTUs，占所有樣品OTU總數的8.62%；BCK、B2和B4中獨有OTU分別占14.95%、20.20%和27.21%（圖2）。在所有樣品中共鑒定到細菌36個門、56個綱、81個目和175個科、438個屬。在門的水平上，占優勢的門到屬依次為Proteobacteria（變形菌門）、Alphaproteobacteria（變形菌綱）、Sphingomonadales （鞘脂單胞菌目）、Sphingomonadaceae（鞘脂單胞菌科）和Sphingomonas（鞘脂單胞菌屬），分別占OTUs的 83.09%、53.96%、31.13%、31.62% 和30.62%（圖1）。通過計算不同分類水平上鑒定出來的種系型，不同發病程度的細菌種類主要分布在Proteobacteria （變形菌門），優勢綱則為 Alphaproteobacteria與 Betaproteobacteria（B-變形菌）。在屬的水平上，它們在不同的病情等級上具有不同的相對豐度，表生細菌優勢菌為Sphingomonas（鞘脂單胞菌屬）與Ralstonia（雷氏菌屬）。

2.2 發病程度對葉片細菌的影響

本研究對比了3種不同病情等級下細菌群落組成的差異。運用Beta多樣性指標來比較多組樣品之間的差異，結果表明，細菌群落在3個不同病情等級上具有差異。雖然隨著發病病情指數增加而增加，葉際細菌豐度逐漸增加，說明病情越重，獨特的OTU含量最高，群落結構最為復雜，健康葉片的OTU特異性最低，群落結構相對單一。圖4分析顯示相對含量最多的三個屬Sphingomonas、Ralstonia與Stenotrophomonas，在B2與B4中菌類逐漸減少，而增幅明顯的兩種菌則為Methylobacterium與Hymenobacter，B4菌類最多，其中獨有的分別有 Ethanoligenens、Taibaiella、Rubinisphaera、Microbacter與Phaselicystis，此結果與VENN圖2結果保持一致。

表1 不同病情指數樣品OTU統計表Table 1 OTU statistics samples from samples with different severities

表2 樣品OTU基本情況統計表Table 2 Basic OTU Statistics of Samples

圖1 OTU數目與聚類similarity值關系圖Fig.1 Relation between OTU Number and Cluster Similarity Value

圖2 不同病情指數樣品OTU韋恩圖Fig.2 Venn diagram illustrating the number of OTUs from samples with different severities

圖3 genus水平上所有樣本聚類樹Fig.3 Cluster Tree of All Samples at Genus Level

圖4 genus水平所有樣本群落結構分布Fig.4 Distribution of community structure in all samples at genus level

Alpha 多樣性（Alpha Diversity）所指的是單個樣品中菌群多樣性的分析，是由樣品中的物種組成的豐富度（Richness）和均勻度（Evenness）這兩個因素組成，一般以Chao1和Shannon 等指數來評估某個樣本的菌群多樣性，指數越高，說明樣本的多樣性越復雜。不同樣本的alpha多樣性分析指數統計（表3）結果顯示細菌多樣性B4＞BCK＞B2。表明發病程度的不同能夠影響細菌的群落組成和結構。

應用多樣性距離矩陣歸類分析發現，茶白星病顯癥的B2、B4的OTU在豐度上聚為一類，而CK單獨一類（圖3）。在門的水平上研究，Proteobacteria與Firmicutes一直下降，而Bacteroidetes與Acidobacteria則上升；而在屬水平上，Ralstonia與Stenotrophomonas下降，Methylobacterium與Hymenobacter則隨著病情等級提高而逐漸升高，Methylobacterium在Bck、B2、B4中相對豐度分別為0.58%、11.40%和15.05%，而Hymenobacter相對豐度分別為0.54%、6.60%和9.63%（表4）。

2.3 不同病情等級下細菌功能預測

從16 s測序獲得的物種構成推測樣本中的功能基因構成，通過Bray-Curtis算法構建的樣本聚類樹與功能豐度柱狀圖結合起來，發現B4與B2相似性較大，其中菌類組成相比對照依次增加（圖5）。P值檢驗的兩兩差異統計功能預測如表5，表明隨著茶白星病病情嚴重，其中較大功能變化的編碼功能主要為細胞壁生物發生、脂質運輸和代謝、輔酶運輸和代謝、碳水化合物的運輸和代謝等。但其中在B4功能預測中增幅較大的為細胞活力與次生代謝物的生物合成。蛋白質轉換及細胞運動等 RNA加工和修飾、胞外細胞內運輸、分泌和囊泡運輸、防御機制、運輸、分解代謝、翻譯后修飾、輔酶運輸、代謝與翻譯及核糖體結構和生物發生的功能被預測，則隨著茶白星病發病嚴重而減少。

表3 不同病情等級樣品的alpha多樣性指數統計表Table 3 Alpha diversity index statistics from samples with different disease severties

表4 不同病情等級樣品在門與屬中的相對豐度表（%）Table 4 Relative abundance tables of samples of different disease grades in phylum and genus（%）

圖5 基于COG的所有樣品聚類樹與柱狀圖組合分析圖Fig.5 Combination analysis of clustering tree and histogram for all samples based on COG

表5 差異比較結果功能預測表Table 5 Functional prediction of difference comparison results

3 結論與討論

細菌是地球上豐富且多樣化的物種，目前人們對茶園根際微生物區系已有基本的了解。雖然葉際作為植物上主要的細菌棲息地，為細菌的定殖提供了良好的生活環境，在保護寄主植物免受病原菌侵染方面也具有至關重要的作用，葉際細菌正逐漸被人們所關注，但對茶樹地上部分微生物區系的系統研究尚剛起步，有限的研究表明茶園葉面微生物主要是真菌和細菌。細菌主要有芽孢桿菌屬（Bacillus）、短桿菌屬（Curtobacterium）、節細菌屬（Arthrobacter）、黃單桿孢菌屬（Xanthomonas）、紅球菌屬（Rhodococcus）、假單孢桿菌屬（Pseudomonas）、黃桿菌屬（Flavubacteria）、棒狀桿菌屬（Coryhebacterium）、微球菌屬（Microccocus）和紅螺菌屬（Rhodospirillum）等[23]，

本研究運用宏基因組細菌分類測序對3個不同病情等級下的細菌檢測，結果表明Acidobacteria（酸桿菌門）、Bacteroidetes（擬桿菌門）、Proteobacteria（變形菌門）和Firmicutes（厚壁菌門）在3個病情等級下均為優勢門類，且均為優勢低溫纖維素降解菌[24-25]。Proteobacteria（變形菌門）為絕對優勢菌門，占總數的73.53%～90.25%，也是其他植物葉際優勢的細菌門類[26-27]。Acidobacteria（酸桿菌門）與Bacteroidetes（擬桿菌門）相對豐度與多樣性的變化趨勢一致，呈正相關。Methylobacterium（甲醇桿菌屬）與Hymenobacter（膜桿菌屬）的相對豐度與病情指數正相關。其中Methylobacterium以甲醇為唯一碳源的菌類，因而具有降乙酰甲胺磷[28]等功效，并對部分細菌與真菌具有抗性[29]。而主要來自山地[16]和凍土[17]的Hymenobacter菌類，適應相對低溫環境，它們可能與致病菌存在協同作用。而Ralstonia（雷氏菌屬）與Stenotrophomonas（寡養單胞菌）豐度出現下降，Ralstonia與Stenotrophomonas是引起植物青枯與腐爛的病原菌屬[30-31]。茶白星病病情升高，葉際環境中致病菌的豐度下降的測定結果與高海拔茶區茶白星病嚴重發生并抑制其它病害的特點相符。

細菌中致病菌不僅影響植物健康，也影響植物相關細菌的組成和結構。OTU差異分析發現3個不同病情等級下細菌群落組成存在差異，表明茶白星病致病菌不僅影響植物健康，也影響茶葉葉際中細菌的組成和結構。細菌群落多樣性隨著病情的提高逐漸升高，細菌之間的互作高度復雜，單個病原體或有益細菌的豐度變化都可能導致整個細菌組成的改變，推測可能因為茶白星病是一種真菌病害，主要抑制真菌群落。通過對宏基因組測序數據功能比較分析發現防御機制著提升，表明細菌群落在茶白星病發病進程中起一定的效應，但具體的反應模式還有待進一步研究。