黑升麻提取物對人肝癌細胞系HepG2增殖和凋亡的影響

倪 璠，柯 陽，鄒仁超，艾潤垚，馬瑞成，周 劍，郭志唐，王 琳※

(1.昆明醫科大學第二附屬醫院肝膽胰外科，昆明 650101； 2.昆明醫科大學，昆明 650500)

肝細胞癌是全球癌癥發病率排名第六位，癌癥致死人數排名第四位的惡性腫瘤[1]。目前早期肝細胞癌的治療主要以外科手術切除為首選[2]，但術后復發率高，預后較差。因此，探索抑制肝細胞癌發生發展的分子機制，尋找更有效安全治療藥物是當務之急。黑升麻為毛茛科植物，廣泛生長于歐洲、北美及亞洲。其傳統藥用部分為根及莖，其中主要成分為兩大類化合物三萜糖苷和苯丙素類。美國原住民一直將其用作解熱鎮痛、抗炎劑[3]。1820年被載入《美國藥典》，黑升麻用于治療圍絕經期綜合征已有100多年歷史，而相關研究普遍認為其體內作用機制異于雌激素[4-5]。大量實驗表明黑升麻提取物不僅不會增加患乳腺癌的風險[6]，反而對乳腺癌細胞生長具有抑制作用[7-11]。而在體外實驗中，給予Spragne-Dawley雌性小鼠口服高濃度黑升麻提取物可有效降低小鼠乳腺癌的發生率[12]。近年來研究發現，三萜糖苷中的Actein對膠質瘤、胃癌、膀胱癌、前列腺癌等腫瘤細胞生長同樣具有抑制作用[13-17]。本研究擬探討黑升麻提取物對人肝癌細胞系HepG2增殖和凋亡的影響，期待發現新的抗肝細胞癌藥物。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗藥物和細胞株 黑升麻提取物(三萜皂苷含量8%)S27368-100 g購自上海源葉生物科技有限公司。HepG2(人肝癌細胞)購自昆明動物所。

1.1.2主要試劑及儀器 DMEM/F12(dulbecco′s modified eagle medium/F12)基礎培養基、胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗、谷氨酰胺、細胞計數試劑盒8(cell counting Kit-8，CCK-8)、Annexin V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-fluoresceine isothiocyanate/propidium iodide，Annexin V-FITC/PI)凋亡檢測試劑盒購自上海東仁化學公司；RIPA(Radio Immunoprecipitation Assay)裂解液，二辛可寧酸蛋白濃度測定試劑盒，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)蛋白上樣緩沖液(5X)購自中國碧云天公司。增強型化學發光液顯色液購于美國Millipore公司，麗春紅染色液、牛血清白蛋白購于北京索萊寶公司。內參一抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)購自中國Abmart公司。檢測二抗辣根過氧化物酶標記通用型二抗購于美國CST公司。丙烯酰胺、SDS、甘氨酸、三羥甲基氨基甲烷、四甲基乙二胺均購于美國Sigma/Amresco公司。蛋白酶抑制劑Phenylmethanesulfonyl fluoride(PMSF)、磷酸化蛋白酶抑制劑購自瑞士Roche公司。儀器：恒溫干燥箱(日本SANYO公司)，自動消毒鍋(日本SANYO公司)，-80 ℃超低溫冰箱(美國Thermo公司)，掌上離心機(中國白鴿公司)，低溫離心機HITACH(日本CF-16RX公司)，全波長分光光度計(上海UNICO公司)，酶標儀(美國Thermo公司)，凝膠成像儀、垂直電泳槽、濕式轉膜槽(美國BIO-RAD公司)，封口機(中國上海麥爾多公司)，靜音混合儀(中國其林貝爾公司)，Whatman濾紙(3 mm)(美國GE公司)，高速冷凍離心機(美國Thermo scientific公司)，流式細胞儀(德國Parc Gmbh，CyFlow Space公司)，CO2培養箱(中國力康生物公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養 HepG2細胞用DMEM/F12+10%胎牛血清+1%雙抗+1%谷氨酰胺，37 ℃、5% CO2條件下培養，每兩天傳代一次，取對數生長期細胞進行實驗。

1.2.2黑升麻提取物對HepG2細胞增殖的影響 黑升麻提取物用二甲基亞砜配制成50 mg/mL的儲存液，4 ℃冰箱避光保存。接種HepG2細胞至96孔板內，每孔接種5 000個細胞，按以下實驗條件分組并更換培養基：空白孔(加含30 μg/mL黑升麻提取物的DMEM/F12基礎培養基，未接種細胞)、黑升麻藥物濃度0、10、20、30、40、50 μg/mL組的DMEM/F12基礎培養基，每組3個孔重復，每孔液體量為100 μL。細胞培養箱內培養48 h(5% CO2，37 ℃)，每個孔加入10 μL的CCK-8試劑，CO2培養箱內孵育2 h，酶標儀450 nm波長下檢測吸光度，收集數據，計算細胞抑制率。細胞存活率=(實驗組-空白孔)/(對照組-空白孔)×100%。

1.2.3流式細胞術檢測黑升麻提取物對HepG2細胞凋亡的影響 接種HepG2細胞至6孔板內，每孔接種105個細胞，當細胞融合度達到70%時，將HepG2細胞培養基更換為含黑升麻0、10、20、32 μg/mL的DMEM/F12基礎培養基。磷酸緩沖鹽溶液洗滌細胞2次，0.25%胰蛋白酶消化細胞，完全培養基終止消化。以離心半徑8 cm，1 000 r/min離心3 min，棄上清。加入磷酸緩沖鹽溶液后1 000 r/min離心3 min，棄上清(重復該步驟兩遍)。加入200 μL Annexin V Binding Buffer，重懸細胞，隨機取100 μL細胞懸液，加入新的1.5 mL離心管中，向細胞懸液中加入5 μL Annexin V-FITC結合物，5 μL的碘化丙啶。室溫下避光染色15 min，每管加入900 μL磷酸緩沖鹽溶液，加樣到流式細胞儀檢測。

1.2.4Western blot檢測Cleaved caspase-3、caspase-8、caspase-9蛋白的表達 向黑升麻0、10、20、32 μg/mL組細胞6孔板中分別加入100 μL的RIPA裂解液(含1 μL蛋白酶抑制劑)，冰浴上裂解15 min，細胞刮刀刮取細胞收集到1.5 mL離心管中，低溫高速離心機中離心(4 ℃，12 000 r/min,離心半徑10 cm)加入100 μL SDS上樣緩沖液，93 ℃水浴10 min，-20 ℃保存備用。根據二辛可寧酸試劑盒說明書操作測定蛋白濃度，調整各個樣品的蛋白上樣量為80 μg進行SDS-PAGE電泳，電泳結束后將蛋白轉移到聚偏二氟乙烯膜膜上，將聚偏二氟乙烯膜膜置于5%的牛血清白蛋白中，室溫(20～30 ℃)封閉1.5 h，脫色，吸干牛血清白蛋白液，加入一抗2 mL，4 ℃冰箱中過夜。去除一抗后TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min。加入酶標二抗，室溫孵育2 h。TBST洗膜3次，每次10 min。增強化學發光顯色液顯色處理后，暗室中曝光。

2 結 果

2.1黑升麻提取物抑制HepG2細胞增殖 各組抑制率比較差異有統計意義(F=139.300,P<0.05),隨著各組給藥濃度的增加抑制率逐漸升高(P<0.05)，存活率逐漸降低。黑升麻IC50為32.010 μg/mL。見表1。

組 別實驗孔OD值抑制率(%)存活率(%)0 μg/mL組3.16±0.09010010 μg/mL組1.29±0.0212.51±9.31a87.49±9.3120 μg/mL組1.09±0.0727.85±1.51ab72.15±1.5130 μg/mL組0.75±0.0553.20±5.55abc46.80±5.5540 μg/mL組0.57±0.0367.42±3.54abcd32.58±3.5450 μg/mL組0.38±0.0181.43±0.73abcde18.57±0.73

a與0 μg/mL組比較，P<0.05；b與10 μg/mL組比較，P<0.05；c與20 μg/mL組比較，P<0.05；d與30 μg/mL組比較，P<0.05；e與40 μg/mL組比較，P<0.05

2.2黑升麻提取物促進HepG2細胞凋亡 各組細胞經Annexin-V-FIFC/PI雙染后，與0 μg/mL組相比，10 μg/mL組、20 μg/mL組、32 μg/mL組早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞所占百分比明顯增加，且隨著黑升麻提取物給藥濃度的增加，凋亡細胞所占百分比明顯增加，見圖1A、1B、1C、1D。HepG2細胞系中，黑升麻提取物10、20、32 μg/mL給藥濃度處理后凋亡細胞百分比與0 μg/mL組對比顯著增高(P<0.05),見圖1E。

2.3黑升麻提取物促進HepG2細胞Cleaved caspase-3、8、9蛋白表達 HepG2細胞中，與0 μg/mL組比較，20、32 μg/mL組Cleaved caspase-3蛋白表達升高(P<0.05)；與0 μg/mL組比較，32 μg/mL組Cleaved caspase-8蛋白表達升高(P<0.05)；HepG2細胞中，不同藥物濃度處理后Cleaved capase-9蛋白表達比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

3 討 論

黑升麻根莖被德國E委員會批準為治療經前期綜合征和絕經綜合征的自主神經癥狀的非處方藥，含其主要成分的產品臨床研究已被美國草藥典收錄，相應的市售藥品名為莉芙敏片[18]。相較于更年期綜合征的傳統激素療法，尚未見黑升麻相關藥品有增加乳腺癌、心血管疾病、卒中風險的相關報道，而目前認為其相應作用機制主要與選擇性雌激素受體調節、5-羥色胺通路調節機制，抗氧化作用、炎癥反應等相關[4]。現普遍認為黑升麻作用機制異于雌、孕、雄激素，亦不同于植物激素。有實驗支持黑升麻在癌癥患者中的應用是安全的，對于乳腺癌、前列腺癌等激素依賴性腫瘤細胞具有抗增殖作用[19]。因此，基于已有實驗結果，為探求新的抗腫瘤藥物，本研究主要探究黑升麻對肝癌細胞HepG2凋亡的影響及可能的作用機制。

1A：10 μg/mL組；1B、1C、1D分別為10、20、32 μg/mL濃度的黑升麻提取物處理48 h后人肝癌細胞HepG2細胞凋亡比率；1E:流式細胞實驗凋亡細胞數據分析；*與0 μg/mL組比較，P<0.05；#與10 μg/mL組比較，P<0.05；△與20 μg/mL組比較，P<0.05

圖1黑升麻提取物處理HepG2細胞48h后凋亡檢測

2A：Western blot凝膠圖像(Cleaved caspase-3蛋白檢測過程出現兩條印跡是caspase-3活化時被剪切成19 000和17 000的兩個小蛋白，取19 000條帶檢測灰度值)； 2B、2C、2D分別為Cleaved caspase-3、8、9在HepG2細胞中的表達情況及分析[GAPDH(abmart m20006)為內參，Image J灰度掃描，計算各組相對灰度值]；*與0 μg/mL組比較，P<0.05

圖2黑升麻提取物促進HepG2細胞Cleavedcaspase-3、8、9蛋白表達

腫瘤細胞是通過在細胞內外過度表達抗凋亡因子，使平衡朝向自身生存，對細胞凋亡抵抗，從而導致腫瘤生長控制的喪失[20]。本實驗發現黑升麻可以抑制HepG2增殖，促進HepG2凋亡。有研究顯示，黑升麻單體Actein可以抑制在膠質瘤U87細胞和U251細胞集落形成，增加促凋亡因子Bax、caspase-3和caspase-9片段以及多聚合酶1的表達，減少抗凋亡基因Bcl-2的表達，從而抑制腫瘤生長，其相關的生物學活性基礎可能是觸發線粒體介導的細胞凋亡通路[13]。在胃癌SNU-216、AGS細胞系體外實驗和異種移植至小鼠體內實驗中，Actein可以聯合腫瘤壞死相關凋亡誘導酶，并增強對該酶不敏感的胃癌細胞對腫瘤壞死相關凋亡誘導酶的敏感性，從而上調p53中誘導受體1和2，下調抗凋亡基因Bcl-2家族中的Bcl-2、Mcl-1的表達從而誘導線粒體凋亡[14]。膀胱癌BIU-87、T24、T739、5637細胞系的體外實驗發現Actein可以誘導癌細胞在細胞周期G2/M生長停滯，伴隨自噬小體形成，自噬相關蛋白微管相關蛋白輕鏈3B-Ⅱ集聚，caspase-3、caspase-8、caspase-9均被活化切割，研究者認為相關機制可能是Actein抑制蛋白激酶B和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路，激活c-Jun氨基端激酶磷酸化引起腫瘤細胞凋亡自噬[15]。在給予二乙基亞硝胺誘導產生早期肝癌的C45B2/6小鼠靜脈注射Actein，發現其可有效緩解肝臟組織纖維變性，減輕炎癥反應，逆轉肝損傷，下調血清中甲胎蛋白的表達，相關機制可能是抑制Hedgehog信號通路，促進p53信號通路作用[16]。而黑升麻的單體BN0-1055已被證明在前列腺癌細胞系LNCaP、PC3、DU145中，BNO-1055可以通過抑制補救合成途徑對細胞外核苷的吸收從而抗腫瘤細胞增殖，而該部分作用被認為主要與BNO-1055削弱了核苷平衡轉移蛋白依賴轉移體作用相關[17]。但目前對于黑升麻及其單體促進腫瘤細胞凋亡的作用機制尚未完全闡明。

本研究進一步發現黑升麻促進HepG2細胞caspase-8、caspase-3蛋白酶原激活切割，但未促進caspase-9片段形成。caspase-8是死亡受體通路下游的啟動凋亡程序酶[21]，當腫瘤壞死因子R1、Fas、死亡受體4/5等死亡受體與相應受體結合形成死亡誘導信號復合體時，細胞凋亡的外在途徑就會被激活[22]。caspase-3是由CASP3基因編碼的，外部死亡受體途徑和內在線粒體途徑啟動后共同的效應酶，在凋亡肝癌細胞中明顯表達[23]。而caspase-9由CASP9基因編碼的凋亡啟動蛋白酶，通過磷酸化進行調控激活，引發線粒體內部活化凋亡途徑。誘導細胞凋亡是癌癥治療中細胞死亡的首選模式[24]，是癌癥治療關鍵。因此,進一步明確黑升麻提取物是否引起死亡受體通路上游受體的過表達及具體相應的信號通路將成為后續研究重點。其次，黑升麻提取物對正常肝細胞毒性也需要進一步實驗。

綜上所述，黑升麻提取物能夠抑制肝癌HepG2細胞增殖，促進凋亡，其機制可能與caspase-8介導的外源性死亡受體途徑相關。黑升麻具有潛在的抗癌作用，但具體機制需進一步研究。