來曲唑對子宮肌瘤細胞增殖凋亡的影響及其作用機制

劉玨 張瀟迪 張群鋒

南華大學附屬第二醫院婦產科（湖南衡陽421001）

研究發現，芳香化酶在子宮肌瘤組織中過度表達，是合成雌激素的重要酶［1］。高度特異性的來曲唑是人工合成的第3 代非甾體類芳香化酶抑制劑，可抑制芳香化酶而降低激素水平，進一步消除或減輕雌激素刺激腫瘤生長的作用［2-3］。目前，來曲唑已在子宮肌瘤、子宮內膜癌、乳腺癌等許多雌激素依賴性腫瘤治療中發揮關鍵的作用［4］。本研究擬探討來曲唑作用雌二醇（E2）、B 細胞淋巴瘤-2 基因（bcl?2）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase?3）的表達對子宮肌瘤細胞增殖與凋亡的影響，探討其可能的作用機制，為臨床治療子宮肌瘤提供新治療途徑與借鑒。

1 材料與方法

1.1 標本采集與細胞培養 選取2015年3月至2016年1月在南華大學附屬第二醫院手術切除的的8 例子宮肌瘤標本（病理學證實）。無菌條件下取肌瘤組織約1 cm3，放入4 ℃、無菌、含抗生素的PBS 緩沖液轉移到細胞培養室。PBS 洗滌3 遍后剪碎至＜1 mm3，離心管內靜置，去上清后加入含800 U/mL I 型膠原酶的DMEM 培養基，于37 ℃消化成單個細胞后用PBS 液終止消化。過濾細胞懸液后經1 500 r/min 離心10 min 收集細胞。加入DMEM 懸浮并接種，置于含5% CO2的37 ℃恒溫箱里培養24 h 后，觀察細胞貼壁的生長情況。當細胞鋪滿瓶底接近80%～90%時即可傳代。用臺盼藍染色，觀察細胞活性并記數，在24 孔細胞培養 板接種5 × 105/mL 后在含5% CO2的37 ℃恒溫箱里繼續培養。細胞用α?actin 抗體進行免疫細胞化學法染色鑒定。后續實驗取對數期細胞分為5 組，空白組加入相同量的DMSO 子宮肌瘤細胞，與4 組10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L不同濃度的來曲唑組。DMSO 溶解來曲唑且濃度低于1%。

1.2 材料與試劑 胎牛血清（FBS，Hyclone 公司）；RPMI?1640 細胞培養液（美國GIBCOBRL）；MTT（華美生物）；二甲基亞砜（DMSO，分析純，江蘇鴻聲）；Western blot 試劑、免疫熒光試劑（上海碧云天）；0.25%胰酶（吉泰科技）；免疫組化試劑（SP9000 試劑盒、DAB 顯色劑）購自北京中杉金橋；臺盼藍等染色液及Triton X?100（10%）購自北京索萊寶；日本Takara 公司的RT?PCR 試劑（逆轉錄試劑盒、SYBR Green I Mix PCR 試劑）；RT?PCR 引物（上海生工）；PVDF膜（0.45 μm，美國Millipore）；來曲唑原藥（美國Sigma?Aldridi）；兔抗人α?actin、bcl?2和caspase?3 抗體以及辣根過氧化物酶標記二抗（美國Santa Cruz）。

1.3 儀器與設備 3111 型CO2培養箱、CL17R 型冷凍高速離心機均購自Thermo Forma 公司；低溫冰箱購自SANYO公司；上海中順SENCO R?201旋轉蒸發儀；蘇州安泰的SW?CJ?1F 層流超凈生物學工作臺；美國Dynatech 公司的EPICS XL 型流式細胞儀；美國BioTek 公司的ELX808 酶聯免疫檢測儀；美國Bio?Rad 公司的蛋白印記檢測系統與凝膠成像儀；Step One PLUS 熒光定量PCR 儀；羅氏480 熒光定量PCR 儀，Leica Bond?Max 免疫組化儀，Bio?Rad S1000 梯度PCR 儀；日本Olympus 公司的XPS?18 型倒置熒光顯微鏡。

1.4 試驗方法

1.4.1 MTT 試驗 用胰蛋白酶消化細胞后，將1×105/mL 接種于96 孔板中，封閉，鋪板，調零，加入來曲唑，繼續培養24、48、72 h。每日測定每組細胞的吸光值（A）值。實驗終止前4 h，添加20 μL MTT試劑，繼續孵育＞4 h。每孔添加200 μL DMSO，振蕩10 min，測定490 nm 處A值，繪制生長曲線。細胞增殖抑制率（%）=1-（A藥物組-A空白組）/（A細胞對照組-A空白組）×100%。

1.4.2 細胞凋亡率檢測細胞增殖能力 來曲唑作用對數期細胞后，轉移懸液，1 500 r/min離心5 min，棄上清液用PBS 洗2 次，加入400 μg/mL 碘化丙啶，10 μg/mL Rnase，300 μL Triton?100，每組設3 個復孔。在室溫下避光染色20 min 后，流式細胞儀檢測，計算細胞凋亡率。

1.4.3 測定E2含量 來曲唑作用72 h后，3 000 r/min離心20 min，棄上清液，-20 ℃凍存。采用放射免疫法測定E2 水平。

1.4.4 逆轉錄聚合酶鏈反應技術（RT?PCR） 采用Trizol 試劑提取各組總RNA，并制備cDNA。將β?actin為內參照物，定量檢測bcl?2、caspase?3 mRNA表達水平。其中，β?actin 引物序列，上游5′?CCAT?CATCTTGCAGGAGCG?3′，下游5′?CTGGCAGTGA?GCTATACTCG?3′；bcl?2 引物序列，上游5′?TCTG?GTCCCTTCCAGCTAGT?3′，下游5′?CAGGGAGGCT?AAGGGGTA?3′；Caspase?3 引物序列，上游5′?CT?TTCTCAAGGACCACCG?3′，下游5′?TCACTTGGCA?TACAAATCA?3′；將cDNA、引物和SYBR Green 混合，分別在94 ℃、50 s，55 ℃、50 s，72 ℃、50 s，72 ℃、10 min，循環40 次，用焦碳酸二乙酯補齊20 μL 體系。每組均設復孔3 個，每次重復3 次，對每個樣品CT 值按照2?ΔΔCT法統計分析mRNA 表達水平。

1.4.5 Western blot 法檢測bcl?2、Caspase?3 蛋白表達 檢測各組總蛋白，利用8% SDS?PAGE 電泳50 μg總蛋白后，轉膜后，用5%脫脂牛奶封閉1 h后加入一抗，4 ℃孵育12 h。TBST 清洗3 次，10 min/次，加入1∶300 稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗，重復清洗，最后暗室曝光檢測蛋白條帶。

1.5 統計學方法 采用SPSS 16.0 進行數據統計學分析，計量資料用表示，采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 來曲唑對子宮肌瘤細胞增殖的影響 與來曲唑作用子宮肌瘤細胞增殖抑制率呈時間與濃度呈正相關（均r＞0.7，均P＜0.05）。見圖1。

2.2 來曲唑對子宮肌瘤細胞凋亡率的影響 來曲唑作用子宮肌瘤細胞凋亡率呈時間與濃度呈正相關（均r＞0.8，均P＜0.05）。見圖2。

2.3 來曲唑對子宮肌瘤細胞分泌E2 的影響 與來曲唑0 mol/L 組比較，隨著藥物濃度的增加，E2水平明顯降低（P＜0.05），而來曲唑濃度呈越高E2水平越，呈濃度負相關性（均r＜-0.6，均P＜0.05）。見圖3。

2.4 來曲唑對子宮肌瘤細胞bcl?2、caspase?3 表達的影響 來曲唑作用子宮肌瘤細胞72 h 后，bcl?2、bcl?2 mRNA 蛋白表達水平隨來曲唑濃度增加而降低（P＜0.05），與濃度呈負相關（均r＜-0.7，均P＜0.05）；而caspase?3、caspase?3 mRNA 蛋白表達水平隨來曲唑濃度增加而上升，與濃度呈正相關（均r＞0.8，均P＜0.05）。見圖4、5。

圖1 來曲唑對子宮肌瘤細胞增殖的影響（n=8）Fig.1 Effect of letrozole on proliferation of uterine leiomyoma cells

3 討論

研究表明，來曲唑抑制雌激素合成后，既不會使雄激素在體內大量積蓄，也不會影響孕激素水平，同時也不會降低腎上腺皮質醇和醛固酮水平［3］。來曲唑不同于其他非甾體芳香化酶抑制劑，其結合亞鐵血紅蛋白中的鐵原子，能可逆地抑制芳香化酶與雄激素底物結合，阻斷雄激素催化為雌激素，不影響其他甾體激素生物合成［5］。人體的藥代動力學研究表明［6］，口服來曲唑的生物利用度高達99.9%，可快速阻斷雌激素合成路徑，快速降低雌激素水平，縮小子宮及肌瘤體積；同時來曲唑半衰期長，且幾乎所有代謝產物經腎臟排泄，毒副作用非常小。目前，來曲唑治療子宮肌瘤的研究較少，鮮有系統的體外實驗研究報道。

圖2 來曲唑對子宮肌瘤細胞凋亡率的影響（n=8）Fig.2 Effect of letrozole on apoptosis rate of uterine leiomyoma cells

圖3 來曲唑對子宮肌瘤細胞分泌E2 的影響（n=8）Fig.3 Effect of letrozole on E2 secretion in uterine leiomyoma cells

圖4 Western blot 法檢測各組bcl?2、caspase?3 的表達Fig.4 The expression of bcl?2 and caspase?3 in each group by western blot

WHYNOTT 等［7］研究顯示，促性腺激素釋放激素激動劑（GnRH?α）具有保護宮頸癌患者的卵巢功能，縮小肌瘤體積。SCARPELLINI 等［8］研究認為芳香化酶抑制劑在治療晚期和復發性子宮內膜癌方面的臨床益處有限，而RASDOSLAW 等［9］發現芳香化酶抑制藥與老年女性患者雌激素分泌密切相關。BOGLIOLO 等［10］認為芳香化酶是合成雌激素的重要酶，影響著子宮肌瘤的發生發展。本研究組早前研究［11］發現利用來曲唑與GnRH?α 治療子宮肌瘤體積均明顯減小，但來曲唑治療患者的血清學改變，GnRH?α 治療患者的激素水平降低。ZHOU 等［12］研究發現來曲唑治療能顯著降低子宮肌瘤的大小和促進子宮肌瘤細胞的凋亡。本研究顯示，來曲唑處理子宮肌瘤細胞后呈濃度與時間正相關。

圖5 來曲唑作用子宮肌瘤細胞72 h 后對子宮肌瘤細胞bcl?2、Caspase?3 表達的影響Fig.5 Effect of letrozole on expression of bcl?2 and caspase?3 in uterine leiomyoma cells after 72 h treatment

ZHENG 等［13］研究表明bcl?2 在正常子宮肌層中呈低表達，在子宮肌瘤組織中呈高表達。本研究顯示來曲唑能抑制子宮肌瘤細胞增殖，促進其凋亡。另外，本研究還發現來曲唑作用子宮肌瘤細胞表現出與濃度呈正相關，其機制可能與來曲唑下調bcl?2 表達和上調caspase?3 表達有關。此外，本研究亦發現來曲唑顯著性降低了子宮肌瘤細胞E2 水平。因此，推測高濃度來曲唑除了抑制芳香化酶的表達，降低E2 合成，抑制肌瘤細胞增殖，還可能存在直接誘導細胞凋亡的作用，其能否直接誘導子宮肌瘤細胞的凋亡及其機制，有待進一步研究。

綜上所述，來曲唑可能的通過下調bcl?2 和上調caspase?3 表達及降低E2 水平，來發揮抑制子宮肌瘤細胞增殖，促進其凋亡。但來曲唑抑制子宮肌瘤細胞增殖促進凋亡的機制有待更多的作用途徑與信號通路的深入研究。