高危型人乳頭瘤病毒載量和調節性T 細胞對宮頸癌診斷閾值的確定和意義

余楊 付艷麗 衛瑋 何利珍 孫翔

河南理工大學第一附屬醫院（河南省焦作市第二人民醫院）檢驗科（河南焦作454100）

研究表明，近100%的宮頸癌由人乳頭瘤病毒（HPV）感染所致［1-2］，宮頸癌發生隱匿，緩慢演進，癌前病變即宮頸上皮內瘤變（CIN）階段明顯，不同臨床分期的宮頸癌5年生存率相差極大，Ⅰ～Ⅱ期高達80%～90%，Ⅲ～Ⅳ期降至30%～40%［3-4］，因此，宮頸癌和CIN 的早期篩查、診療不僅可行且至關重要。宮頸癌病因明確，但發病過程仍有許多不確定因素，發病機制尚不完全明了，目前已達成的共識：HPV 誘導惡性腫瘤發生不是病毒生命周期中的必然事件，不能用單一理論確切解釋，有關宮頸癌的研究多集中于HPV、宿主、環境這三方面。HPV 的檢測已經由基因分型以降低漏檢率的初篩拓展為病毒復制、蛋白表達、表觀修飾等更注重特異性的精準檢驗［5-7］，宮頸局部免疫微環境研究是基于HPV“非溶細胞”病毒，具有高度組織特異性等自然特性，由免疫抑制細胞構筑的免疫抑制微環境可通過免疫耐受、免疫逃逸等機制促進HPV 持續感染和宮頸病變進展因而備受關注［8］。調節性T 細胞（Treg）是一群發揮外周耐受和免疫抑制功能獨特的輔助性T 細胞亞群，叉頭翼狀螺旋轉錄因子3（Foxp3）是Treg 的特征性分子標志，在多方面對腫瘤免疫應答從啟動識別到產生效應的整個階段全程調控，但將腫瘤抗原HPV 的復制增殖和CD4+CD25+Foxp3+調節性T 細胞（Treg）與宮頸癌的發生進行量效聯系的研究及其診斷閾值確定的報道較少。本實驗分析高危型HPV 載量（HR?HPV DNA）和CD4+CD25+Foxp3+Treg 作為宮頸癌診斷指標的可行性，研究兩指標單一和聯合檢測的診斷性能，確定高靈敏性和高特異性的最佳閾值，探討最優模式在宮頸癌的臨床意義，同時考慮到HR?HPV 載量是針對DNA 的檢測，而HPV E6/E7 mRNA 能較好地反映HPV 致癌基因E6/E7 的表達［6］，故對三個指標間的關系進行了簡單分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇我院2012年1月至2015年9月經液基薄層細胞檢測技術（TCT）篩查、HPV 基因分型檢測（PCR-反向點雜交法），最終宮頸病理活檢三階梯程序確診的HR?HPV 持續性感染的不同宮頸病變病例，包括CIN I 71 例、CIN II 66 例、CIN III 77 例，宮頸癌125 例，年齡范圍34～62 歲，中位年齡46.43 歲，不同宮頸病變組的年齡無顯著差異，具有可比性。HR?HPV 以16 型、52 型、58 型為主，其次31 型、33 型，其余為少見分型。排除標準：（1）孕婦；（2）合并其他惡性腫瘤或自身免疫性疾??；（3）近期使用過免疫抑制類藥物；（4）HIV 陽性；（5）有放化療史；（6）2 周內接受過局部或全身抗病毒藥物治療。持續性HR?HPV 感染的定義［9-10］：HR?HPV 感染者第1年隨訪1 次/4 個月，以后至少1 次/6 個月，在間隔6～12 個月的相鄰2 次隨訪中，同一患者的宮頸檢測樣本均顯示HR?HPV 陽性且為同型，持續時間2年以上，避免短期內重復取樣，間隔時間至少2 個月?；颊咧橥?，隨訪資料完整。

1.2 主要儀器與試劑 采用美國BD FACS Calibur雙激光流式細胞儀，配有BD CellQuest 軟件。鼠抗人FITC?CD4 單克隆抗體、鼠抗人PE?CD25 單克隆抗體、鼠抗人PE?Cy5?Foxp3 單克隆抗體均購自美國eBioscience 公司。PCR 擴增儀DA7600 型和HR?HPV 核酸定量（16、18、31、33、45、52、56、58 共8 型）檢測試劑盒均由中山大學達安基因公司提供。QuantiVirusTM便攜式冷光儀和HR?HPV E6/E7 mRNA（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68 共14 型）檢測試劑盒均購自科蒂亞（新鄉）生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 采用宮頸刷檢物制備宮頸病變單細胞懸液 選擇月經后半周期進行取樣，用陰道窺器充分暴露宮頸陰道部，干棉球拭凈宮頸口過多的黏液、分泌物和血液，觀察宮頸，將刷頭置于宮頸管，其中央較長的刷絲針對新鮮病變部位，順時針旋轉3～5 圈，取下刷頭，并將其浸泡在含液基細胞學保存液的瓶中，用溶血劑去除血液，再用300 目尼龍網過濾雜質，標本轉入試管離心5 min（402×g），棄上清液，PBS 洗滌，密度梯度離心法分離獲取單個核細胞，進行細胞計數，≥106個。

1.3.2 流式細胞儀檢測單細胞懸液中Treg 細胞調整細胞濃度至（1～2）× 107個/mL，用PBS 洗滌、重懸，取上述細胞100 μL，加入FITC?CD4、PE?CD25各5 μL，混勻，室溫避光20 min，加冷固定破膜劑1 mL，4 ℃避光孵育30 min，加破膜緩沖液2 mL，洗滌2 次，棄上清，加PE?Cy5?Foxp3 抗體進行細胞內染色，4 h 內進行流式細胞儀檢測。用空白管調節電壓，以CD25 同型對照調節補償，確定CD4+CD25+細胞群，再以CD4+CD25+細胞設門，以Foxp3 同型對照確定陽性信號，最后測定CD4CD25Foxp3 管，檢測CD4+CD25+Foxp3+細胞占CD4+細胞中的百分率。

1.3.3 HPV DNA 定量檢測 無菌條件下采用宮頸刷插入宮頸內，旋轉數周后停留片刻取出，將宮頸刷置入無菌管，采集的宮頸分泌物及時送檢或4 ℃保存，1 周內檢測。DNA 提取和PCR 擴增按其說明書（PCR 熒光法）進行具體操作。判斷標準：HPV?DNA＞103copies/mL 為陽性。

1.3.4 HPV E6/E7 mRNA檢測 取樣同HPV DNA，采用支鏈DNA（branch?DNA，bDNA）信號擴增法，按照說明書進行如下操作，先將樣品離心5 min（1 610×g），棄上清，加入2 mL 雙蒸水清洗，再次離心，棄上清，加入裂解液混勻，再加入蛋白酶K，65 ℃孵育1 h，留取上清，再經過布板、信號放大、添加底物等過程后放置冷光儀檢測，得到光子數后經軟件轉化為mRNA 拷貝數，以mRNA 拷貝數≥1 copy/mL 為陽性。

1.4 統計學方法 應用SPSS 17.0 軟件進行統計學分析。病毒載量經log 轉換，兩指標聯合包括并聯（任一指標陽性）和串聯（兩指標同時陽性），計算公式：（1）靈敏度=真陽性/（真陽性+假陰性）×100%，特異度=真陰性/（真陰性＋假陽性）×100%；（2）并聯：靈敏度=A 靈敏度+（1-A 靈敏度）×B 靈敏度，特異度=A 特異度×B 特異度；（3）串聯：靈敏度=A 靈敏度×B 靈敏度，特異度=A 特異度+（1-A 特異度）×B 特異度。以病理組織活檢為金標準，繪制受試者工作特性曲線（ROC），比較HR?HPV DNA、CD4+CD25+Foxp3+Treg 單獨和聯合診斷宮頸癌的曲線下面積（AUC），確定最佳閾值，采用診斷試驗四格表法計算評價指標（靈敏度和特異度），預測指標（陽性預測值和陰性預測值）和綜合評價指標（正確率、陽性似然比、陰性似然比、Youden 指數）。采用Pearson 線性相關分析上述兩指標與HPV E6/E7mRNA 表達水平之間的相關性，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 繪制HR?HPV DNA標準曲線 PCR熒光法閾值設定原則是值線剛好超過正常陰性樣品擴增曲線（圖1）的最高點，且循環閾值（Ct）不出現任何數值。以標準品4個濃度（1×103～1×106copies/mL）的對數值為橫坐標，Ct 值為縱坐標，繪制標準曲線（圖2）。Ct 值與樣本起始模板的拷貝數呈正相關，與起始模板拷貝數對數值間有嚴格的線性反比關系。

圖1 PCR 熒光法檢測HR?HPV DNA 的擴增曲線Fig.1 Amplification curve of HR?HPV DNA detection by PCR fluorescence method

圖2 PCR 熒光法檢測HR?HPV DNA 的標準曲線Fig.2 Standard curve of HR?HPV DNA detection by PCR fluorescence method

2.2 HR?HPV DNA、CD4+CD25+Foxp3+Treg 和兩指標聯合檢測對宮頸癌的診斷效能評價 以HR?HPV DNA、CD4+CD25+Foxp3+Treg 和兩指標聯合為檢驗變量，隨訪期限內是否發生宮頸癌為狀態變量，繪制ROC 曲線（圖3），HR?HPV DNA、CD4+CD25+Foxp3+Treg 和兩指標聯檢的AUC 分別為0.615、0.805 和0.825（均P＜0.05，表1）。不同水平的HR?HPV DNA 和CD4+CD25+Foxp3+Treg 診斷宮頸癌的準確性參數見表2，其最佳閾值（靈敏度+特異度最大）分別為6.015 和7.995%，以此為截斷點，HR?HPV DNA、CD4+CD25+Foxp3+Treg、兩項并聯和串聯診斷宮頸癌的效能評價：（1）真實性：靈敏度分別為56.0%、80.8%、93.3%和47.5%，特異度分別為78.5%、74.3%、58.3%和94.5%，陽性似然比分別為2.605、3.144、2.237 和8.636，陰性似然比分別為0.561、0.258、0.115 和0.556，YI 分別為0.345、0.591、0.516 和0.420。（2）收益性：陽性預測值分別為60.3%、64.8%、56.3%和83.1%，陰性預測值分別為75.3%、89.3%、93.2%和75.4%。（3）可靠性：正確率分別為72.3%、80.0%、72.9%和79.3%（表3）。

圖3 HR?HPV DNA、CD4+CD25+Foxp3+Treg 和兩指標聯檢診斷宮頸癌的ROC 曲線Fig.3 ROC Curve of HR?HPV DNA，CD4+CD25+Foxp3+Treg and the combined diagnosis of cervical cancer

表1 HR?HPV DNA、CD4+CD25+Foxp3+Treg 和兩指標聯檢診斷宮頸癌的AUCTab.1 Area under the curve of HR?HPV DNA，CD4+CD25+Foxp3+Treg and the combined diagnosis of cervical cancer

2.3 線性相關分析結果 經Pearson 線性相關分析，HPV E6/E7 mRNA 表達水平與HR?HPV DNA 和CD4+CD25+Foxp3+Treg 均具有正相關性，相關系數依次為0.583 和0.601，均P=0.000。

表2 不同水平的HR?HPV DNA 和CD4+CD25+Foxp3+Treg 診斷宮頸癌的準確性參數Tab.2 Accuracy parameters of HR?HPV DNA and CD4+CD25+Foxp3+Treg in the diagnosis of cervical cancer at different levels

表3 HR?HPV DNA、CD4+CD25+Foxp3+Treg 和兩指標聯合檢測診斷宮頸癌的效能評價比較Tab.3 Effectiveness evaluation comparison among HR?HPV DNA，CD4+CD25+Foxp3+Treg and the two indicators in the diagnosis of cervical cancer

3 討論

宮頸癌的生物標志物多種多樣，臨床常規項目的HPV 基因型檢測具有高靈敏度（優于TCT 92.6%vs.66.0%）［11］、高陰性預測度、高檢測效率的優勢，可明顯降低宮頸癌的漏診率，但HPV 感染的普遍性和自限性特點，使得HPV 檢測特異度低，陽性預測度不高，僅能提示感染，更適合初篩，不能確定是否宮頸病變，更無法對宮頸病變的嚴重程度、發展轉歸方向提供精準信息，可能造成或盲目或過度的治療，而缺乏前瞻性預判很可能錯過CIN到浸潤癌的關鍵節點。宮頸癌發生發展是多因素調控的復雜過程，僅僅HPV 誘導細胞內DNA 突變是不夠的，還需在慢性炎癥的持續刺激下不斷累積變異，再加上微環境改變腫瘤細胞的生物學特性，促發惡性特征轉化的強大激活信號，基因組、微環境、炎癥和免疫體系發生改變的綜合結果導致了癌變的風險［12-13］，因此，基于HPV 感染并能方便無創、準確量化地反映宮頸癌生物學行為變化趨勢的標志物是臨床重點。

本實驗結果顯示：HR?HPV DNA、CD4+CD25+Foxp3+Treg 和兩指標聯檢的AUC，均具有對宮頸癌的預測價值（均P＜0.05），但HR?HPV DNA 的AUC在0.6～0.8之間，準確性中等偏下，明顯低于Treg，提示HR?HPV DNA 在宮頸癌診斷上存在一定局限。HR?HPV DNA 與宮頸癌的關系上尚存一定的爭議，有的研究認為HPV 載量與宮頸癌正向相關［5］，但也有不同的報道認為HR?HPV 病毒載量與CIN和宮頸癌發生有關，但與病變的嚴重程度無關［14］，除外HR?HPV 類型和單一/多重感染的復雜性，機體的反應差異性，一方面病毒復制不一定與樣本采集恰在同一時間點，且HR?HPV 病毒檢測多是游離和整合狀態下總的HPV，不能完全反映HPV病毒的整合狀態，另一方面在高載量慢性病毒感染性疾病中，T 細胞發生表型及功能的缺陷，最終出現T 細胞耗竭，因此病變進展到高級別CIN 和宮頸癌階段后，細胞的惡性轉化可能不再依賴高載量的HR?HPV，反而是免疫抑制狀態下HPV 拷貝數有增加的可能［15-16］，而由本實驗上述兩指標聯合后準確性并未大幅提升也可看出HR?HPV DNA的診斷效能欠佳以及宮頸局部免疫抑制作用較HR?HPV 持續感染的重大，HR?HPV 持續感染是宮頸癌發生的啟動因素，同時還需其他因素協同維持。本實驗數據顯示，HR?HPV DNA 在最佳閾值時有相對略高的診斷特異度，靈敏度和陽性預測值較低，若以6.241 為截斷點，靈敏度和特異度與最佳閾值時相差不大，而在6.375 截斷點，特異度雖有上升，但靈敏度降至46.4%，顯示患癌者和非癌者區間較易發生重疊，整體而言HR?HPV DNA不是準確預測宮頸癌發生很好的指標，但在略高的病毒載量小范圍仍有預警作用，陰性預測值僅為中等偏下水平，不是排除宮頸癌的可靠指標，有證據表明［17-18］，慢性炎癥可觸發促炎介質和免疫抑制細胞的積聚，激活或加重免疫抑制，誘導和促進腫瘤發生發展，且本研究發現HR?HPV DNA 與反映HPV 致癌基因惡性轉化的HPV E6/E7 顯著正相關，因此，筆者認為高載量的HR?HPV 更易誘發慢性炎癥，增加細胞惡化的風險，對較高載量的病毒攜帶者應加強監測。

CD4+CD25+Foxp3+Treg 預測宮頸癌的準確性較高，診斷宮頸癌的最佳閾值為7.995，在此截斷點有較高的診斷靈敏度和陰性預測值，特異度略低于HR?HPV DNA，它的正確率和YI 均高于病毒載量和兩指標聯檢，顯現了其作為診斷指標的可靠性和正確符合率。研究發現，腫瘤微環境具有的異質性，不僅影響CD4+CD25+Foxp3+Treg 的表達水平，且發揮的生物學功能存在致病性差異，一方面免疫逃逸導致機體對腫瘤的免疫無應答或免疫反應低下，廣泛抑制抗腫瘤免疫反應［19］；另一方面，對持續炎癥刺激形成保護性生理防御反應，在防止過強的免疫損傷和清除病原體之間維持平衡，在病毒感染過程中可使組織損傷程度最小化［20-21］。本實驗的研究對象為HR?HPV 持續感染者，高度的炎性環境也可上調Treg 的表達，這可能是其特異性和陽性預測值不高的原因，雖不能反映病情的嚴重程度，但能靈敏地提示免疫調控趨勢變化與宮頸癌的關系，適合監測評估癌癥發展進程和機體的細胞免疫狀態。若以8.250 0 為截斷點，預測宮頸癌的靈敏度和特異度有明顯變化，分別為70.8%和88.8%，特異度顯著提升，靈敏度亦在可接受的中等水平范圍內，陽性預測值78.6%，陰性預測值83.7%，正確率、YI 分別為82.9%和0.596，綜合評價診斷價值高于最佳閾值。選擇最佳靈敏度-特異度平衡所產生的臨界點7.995 抑或更高特異性兼顧敏感度的臨界點8.250 作為CD4+CD25+Foxp3+Treg 的陽性臨界值，筆者建議一是將7.995～8.250 設為灰區，結合其他生物學指標，定期復檢；二是對一過性感染者可選擇較低的7.995 0，以增加靈敏度，減少漏診率，對持續感染者可選擇較高的8.250 0，以增加特異度，減少誤診和過度診療的可能。文獻報道也有相近的結論，持續感染者較一過性感染者Treg 細胞數量增加更明顯，其細胞免疫受抑制的程度更顯著［22-23］，在臨床實際工作中，應結合受試人群特征（如年齡、發病率等）、不同篩檢目的設置一個相對合理的臨界點，或偏重靈敏度或偏重特異度，以提高檢測的相對準確性。

腫瘤細胞發展過程中不可避免地表達一些抗原，這些抗原或通過免疫監視被清除，或通過免疫逃逸形成持續性感染，均會觸發機體抗瘤/抑瘤兩種截然不同的免疫應答，這是本實驗將HR?HPV DNA 和Treg 聯合檢驗的理論依據，樣本均來自同一微環境，減少了異質性的干擾，對抗原和免疫狀態進行同步監測，反應了兩者相互作用導致的病變消長，結果顯示：兩指標并聯時的靈敏度高達93.3%，陰性預測值93.2%，串聯時的特異度高達94.5%，陽性預測值83.1%，因此，在實際工作中有兩指標聯檢的必要性，選擇并聯還是串聯，可適具體情況而定，在特定人群的篩查上可選擇靈敏度高的并聯實驗以減少漏診率，其極高的陰性預測值高說明在排除疾病方面是合理和可靠的方法，若是作為確診指標串聯實驗為最佳模式。