緩激肽釋放酶基因-1多態性位點rs5516與血脂異常及血脂水平的相關性研究

羅 晨 金永鑫 劉潔琳 劉 雅 陳艷語 李 闖 孫東東 王佐廣 溫紹君

血脂異常也稱高脂血癥，是指血清中TC或TG水平的升高，在實際應用中也包括HDL-C水平降低在內[1]。血脂異常與動脈粥樣硬化密切相關，多項國內外前瞻性隊列研究表明，血清TC或LDL-C升高是冠心病和缺血性卒中的危險因素之一，因此防治血脂異常對預防心血管疾病的發生非常重要[2-5]。血脂異常的發生發展除與飲食、運動、吸煙等環境因素有關外，也與遺傳因素相關，某些基因缺陷可導致嚴重的高TG血癥或高TC血癥，而某些基因位點的變異也使得不同個體在脂質吸收、分解、合成代謝等方面存在差異[6]。

緩激肽釋放酶基因1（Kallikrein 1，KLK-1）位于人類19號染色體，其表達產物為緩激肽釋放酶，它主要參與體內緩激肽的生成。緩激肽除有介導血管舒張、血管壁通透性增大等功能外，也有研究表明它還與胰島素敏感性相關[7]。rs5516為KLK-1基因上的一個錯義突變，這個突變導致其翻譯產物第145位上的氨基酸由谷氨酸轉變為谷氨酰胺，有研究推斷其可能與其他有功能的突變位點相互作用從而影響KLK-1基因的表達[8]。因此我們推斷KLK-1基因上的rs5516位點多態性可能通過影響胰島素作用方式從而進一步對血脂代謝產生影響。而國內外少有針對這一方面開展的研究，本文就這一問題進行了分析。

材料與方法

1.研究對象 選取2008年10月至2009年6月，于北京安貞醫院體檢中心及周邊社區接受健康體檢的無血緣關系參與者645例。所有入選對象均無一、二級親屬關系，入選前2周未服用調節血脂藥物及其他對血脂水平有影響的藥物。排除糖尿病、甲狀腺疾病、腎衰竭、繼發性高血壓、心肌病、瓣膜疾病、冠心病及惡性腫瘤的患者。所有入選的研究對象均已簽署知情同意書，研究方案經過首都醫科大學附屬北京安貞醫院醫學倫理道德委員會批準，研究內容符合《赫爾辛基宣言》。

2.方法 （1）臨床信息收集：詳細記錄研究對象的臨床信息。血壓的測量采用標準水銀血壓計，測量前受試者至少休息15 min，坐位連續測量3次，每次間隔不少于5 min，取3次平均值。吸煙者界定為受試者曾吸煙總數≥100支；飲酒者定義為受試者年飲酒次數≥12次[9]。

（2）臨床生化指標的檢測：受試者禁食12 h后，抽取肘正中靜脈血4～5 mL（EDTA-2Na抗凝），以3 000 r/min，離心20 min，分離血細胞與血漿，血漿當日做生化檢測，血細胞于80℃冰箱保存，用于基因多態性檢測。生化指標的檢測包括：TC、TG、HDLC、LDL-C、GLU等[10]。

（3）基因多態性檢測：用EDTA抗凝的采血管收集研究對象的外周靜脈血3-5 mL，保存于-20℃冰箱中。采用改良的酚-氯仿法抽提基因組DNA。利用TaqMan MGB等位基因分型試劑盒根據說明書進行操作，在9700型高通量熒光定量PCR儀上進行PCR反應，最后經ABI HT 7900型熒光掃描儀掃描。用SDS 2.0圖像分析軟件Allelic Discrimination程序進行終點分析，通過檢測不同等位基因所標的FAM和VIC熒光強度，判斷各待測樣本基因分型為野生純合子、雜合子還是突變純合子[11]。

3.研究對象分組 血脂異常診斷標準參考《中國成人血脂異常防治指南（2016年修訂版）》，滿足TC≥6.2 mmol/L，或TG≥2.3 mmol/L，或LDL-C≥4.1 mmol/L，或HDL-C＜1.0 mmol/L之一者即劃入血脂異常組，4項血脂指標均不滿足上述條件者劃入正常對照組。滿足TC≥6.2 mmol/L或LDL≥4.1 mmol/L，且TC＜2.3 mmol/L為高膽固醇血癥；滿足TG≥2.3 mmol/L，且TC＜6.2 mmol/L、LDL＜4.1 mmol/L為高甘油三酯血癥；滿足TC≥6.2 mmol/L或LDL≥4.1 mmol/L，且TG≥2.3 mmol/L為混合型高脂血癥；滿足HDL＜1.0 mmol/L為低HDL-C血癥[1]。高血壓診斷標準參考《中國高血壓防治指南2010》，滿足SBP≥140 mmHg（1 mm Hg=0.133 kPa）和（或）舒張壓≥90 mmHg者劃入高血壓亞組，不滿足上述條件者劃入非高血壓亞組[12]。

4.統計學分析 運用SPSS 23.0統計學軟件進行數據庫建立和統計學分析。正態分布計量資料以均數±標準差表示，非正態分布資料采用中位數（M）及四分位數間距（P25，P75）表示。以Kolmolgorov-Smirnov法對計量資料進行正態分布檢驗，用Levene法進行方差齊性檢驗；如數據呈正態分布且滿足方差齊性，則采用獨立樣本t檢驗或單因素方差分析進行組間比較；如不滿足上述條件，則用Mann-Whitney U檢驗或Kruskal-Wallis H檢驗進行組間比較。計數資料以頻數（率）表示，采用χ2檢驗進行比較分析，如超過1/5的格子理論頻數＜5，則應用Fisher確切概率法進行分析。采用Logistic回歸分析或多元線性回歸分析校正協變量，探索rs5516與血脂異常或血脂水平的相關性。遺傳學Hardy-Weinberg平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）檢驗采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.rs5516與血脂異常相關性研究 （1）臨床資料對比：研究對象臨床資料見表1。共入選研究對象645例，其中血脂異常組320例，對照組325例，病例組與對照組性別、年齡匹配。病例組吸煙比例、SBP、DBP、BMI、TG、TC、LDL-C值高于對照組，差異有統計學意義。兩組飲酒比例、GLU、HDL-C差異無統計學意義。

表1 血脂異常組與對照組臨床資料對比[±s，M（QR），n（%）]

表1 血脂異常組與對照組臨床資料對比[±s，M（QR），n（%）]

項目 血脂異常組（n=320）對照組（n=325） P值年齡/歲 52.86±9.46 52.97±9.59 0.880性別/（男/女） 218/102 221/104 0.973吸煙 111（35.4） 81（25.1） 0.005飲酒 85（27.0） 72（22.3） 0.169 SBP/mmHg 135.55±21.33 129.35±19.56 ＜0.001 DBP/mmHg 87.22±13.90 83.06±13.28 ＜0.001 BMI/（kg/m2） 26.56±4.04 25.49±3.36 ＜0.001 GLU/（mmol/L） 5.425（5.08，5.85） 5.42±0.98 0.060 TG/（mmol/L） 2.35（1.61，3.15）1.31（0.97，1.69）＜0.001 TC/（mmol/L） 5.44（4.63，6.18）4.81（4.30，5.26）＜0.001 LDL-C/（mmol/L）3.520（2.90，4.19） 3.10±0.63 0.021 HDL-C/（mmol/L）0.980（0.90，1.21）1.250（1.12，1.41）0.373

（2）rs5516基因型及等位基因頻率對比：結果見表2。rs5516在對照組人群中符合HWE（χ2=1.24，P=0.26），表明本研究基因型分布具有人群代表性。在血脂異常組中rs5516位點CC、CG、GG基因型頻率分別為3.1%、38.8%、58.1%，對照組相應基因型頻率分別為4.9%、29.8%、65.2%，兩組基因型分布有統計學差異（P=0.042）。C等位基因在病例組中分布頻率為22.5%，G等位基因頻率為77.5%；對照組中C、G等位基因頻率分別為19.8%、80.2%，等位基因在兩組中分布差異無統計學意義。

從表2中可以看出，CC基因型在病例組及對照組中分布頻數均較小，可能會對檢驗效能有所影響，因此我們又將CC+CG合并為C等位基因攜帶者（CC+CG）進行分析。病例組中CC+CG頻率為41.9%，對照組中為34.8%，兩者差異無統計學意義。

（3）各遺傳模型下rs5516與血脂異常相關性分析：結果見表3。在校正了可能對血脂水平產生影響的因素如年齡、性別、是否患高血壓、飲酒、吸煙、BMI、GLU后，rs5516在等位基因模型（OR=1.216，95%CI=0.910～1.624）、加性模型（OR=1.226，95%CI=0.912～1.648）、顯性模型（OR=1.379，95%CI=0.975～1.950）、隱形模型（OR=0.765，95%CI=0.319～1.837）、純合子模型（OR=0.866，95%CI=0.357～2.099）中均與是否患血脂異常無顯著相關性。

（4）亞組分析：結果見表2及表3。以往研究表明，rs5516與高血壓存在相關性[8，13]。因此為排除高血壓患者在病例組與對照組中分布不同而造成的偏倚，將研究對象分為高血壓亞組與非高血壓亞組進一步分析。在高血壓亞組與非高血壓亞組中，CC基因型在病例組中分布頻率均低于對照組，但CC+CG均高于對照組，但這些差異均無統計學意義；而相較于對照組，等位基因C在病例組中有上升趨勢，但差異亦無統計學意義（表2）。在高血壓亞組與非高血壓亞組的Logistic回歸分析中，rs5516在各遺傳模型下與血脂異常亦無明顯相關（表3）。

表2 rs5516基因型及等位基因頻率在總體及亞組中的對比[n（%）]

表3 rs5516多態性與血脂異常多元Logistic分析結果

表4 rs5516基因型及等位基因頻率在各類型血脂異常中的對比[n（%）]

（5）各類型血脂異常分析：結果見表4。血脂異常定義包含了高膽固醇血癥、高甘油三酯血癥、混合型高脂血癥以及低HDL-C血癥，為進一步探究rs5516與血脂的相關性，將血脂異常患者細分為各類型高脂血癥后進行分析。在高TC血癥、高TG血癥、混合型高脂血癥以及低HDL-C血癥中，CCCGGG基因型分布或CC+CGGG分布均無顯著性差異（表4）。在Logistic回歸分析中，rs5516在加性模型、等位基因模型、顯性模型、隱形模型、純合子模型中均與各類型血脂異常無明顯相關（結果未列出）。

2.rs5516與血脂水平相關性研究 （1）臨床資料對比：按基因型分組后研究對象臨床資料見表5。基因型為CC、CG、GG的研究對象年齡、性別匹配，且3組間吸煙者、飲酒者比例差異無統計學意義，SBP、DBP、BMI、GLU水平也無顯著性差異。C等位基因攜帶者（CC+CG）與GG基因型研究對象之間各臨床指標差異亦無統計學意義。

（2）rs5516與血脂水平相關性分析：結果見表5及表6。基因型為CC、CG、GG的研究對象的TG、TC、LDL-C、HDL-C各指標差異均無統計學意義；同樣，C等位基因攜帶者（CC+CG）與GG基因型研究對象之間各血脂指標差異亦無統計學意義（表5）。在多元線性回歸分析中，經校正可能對血脂水平產生影響的因素后，rs5516與與各血脂指標水平無明顯線性相關（表6）。

（3）亞組分析：結果未列出。在高血壓亞組中，各血脂指標水平在CC、CG、GG的研究對象之間或C等位基因攜帶者（CC+CG）與GG基因型研究對象之間差異無統計學意義；經校正可能對血脂水平產生影響的因素，在多元線性回歸模型中，各血脂指標水平也與rs5516無明顯線性相關。非高血壓亞組的分析結果亦然。

表5 各基因型研究對象臨床資料對比[±s，M（QR），n（%）]

表5 各基因型研究對象臨床資料對比[±s，M（QR），n（%）]

項目 CC CG GG P值 CC+CG GG P值年齡/歲 56.039±9.497 53.204±9.763 52.547±9.357 0.165 53.502±9.756 52.547±9.357 0.216性別/（男/女） 19/7 147/74 273/125 0.742 166/81 273/125 0.714吸煙 5（19.2） 59（26.9） 128（32.7） 0.156 64（26.1） 128（32.7） 0.081飲酒 7（26.9） 45（20.5） 105（26.7） 0.227 52（21.2） 105（26.7） 0.117 SBP/mmHg 128.539±18.221 133.931±20.636 131.843±20.838 0.303 133.359±20.427 131.843±20.838 0.368 DBP/mmHg 82.423±12.293 86.379±13.867 84.610±13.729 0.185 85.959±13.740 84.611±13.729 0.228 BMI/（kg/m2） 25.478±2.700 25.858±3.929 26.140±3.699 0.537 25.821±3.821 26.140±3.699 0.310 GLU/（mmol/L） 5.355±0.659 5.360（5.043.5.785） 5.544±1.116 0.430 5.360（5.038，5.783） 5.544±1.116 0.302 TG/（mmol/L） 1.425（1.025，1.645）1.780（1.243，2.480）1.630（1.160，2.253）0.127 1.660（1.220，2.435）1.630（1.160，2.253）0.232 TC/（mmol/L） 5.354±2.104 5.140（4.530，5.670） 5.167±1.293 0.243 5.120（4.53，5.67）4.990（4.44，5.64）0.471 LDL-C/（mmol/L） 3.184±0.756 3.385（2.710，3.918） 3.307±0.831 0.310 3.340（2.708，3.900） 3.307±0.831 0.180 HDL-C/（mmol/L） 1.268±0.272 1.110（0.960，1.330） 1.229±1.036 0.679 1.120（0.960，1.340）1.150（1.000，1.340）0.400

表6 rs5516與血脂水平線性相關分析

討 論

緩激肽釋放酶基因1位于19號染色體長臂1區3帶3亞帶，含有6個外顯子。其表達產物為緩激肽釋放酶，它是一種絲氨酸蛋白酶，分為組織型與血漿型，組織型以活性形式分布于胰腺、甲狀腺、小腸等部位，血漿型則在血液中以無活性的前激肽釋放酶形式存在，在其他蛋白酶水解下方可發揮作用。它的作用底物廣泛，可特異性地水解底物中精氨酸與任意氨基酸之間的肽鍵，而其最為深入研究的功能是水解激肽原為賴氨酰緩激肽，賴氨酰緩激肽之后又可在血液中其他肽酶的作用下生成緩激肽，緩激肽與賴氨酰緩激肽便是人體激肽類物質中最重要的兩種化合物[14-15]。緩激肽與賴氨酰緩激肽可發揮多種生物學功能，包括介導血管舒張、血管壁通透性增大以及痛覺產生等[16]。此外，緩激肽還可以增加胰島素敏感性。以往研究表明，緩激肽與緩激肽受體B2結合后，可以激活磷脂酶C（phospholipase C，PLC）并促進三磷酸肌醇（inositol triphosphate，IP3）的產生，從而介導葡萄糖轉運體4（glucose transporter 4，GLUT4）向細胞外的移位，這可以導致胰島素受體磷酸化，從而增強胰島素的作用；另一方面，緩激肽還可以通過產生一氧化氮（nitric oxide，NO）來增加組織毛細血管血流與通透性，從而更利于胰島素與營養物質通過毛細血管到達組織[7，17]。因此，理論上講，KLK基因突變可以對緩激肽生成產生影響，從而引發胰島素抵抗，進一步引起各種物質代謝紊亂。然而，一些針對KLK-1的研究卻得出了不同的結論，Zhao等[18]在高血壓模型大鼠體內實現組織KLK-1基因過表達后，觀察到了胰島素從較高水平恢復至正常；而Potier等[19]的研究則表明KLK-1基因的缺陷可能對改善胰島素抵抗有幫助。因此，KLK-1基因的改變與胰島素抵抗及物質代謝方面的聯系仍有待于深入探索。rs5516為KLK-1基因在第3個外顯子的位置發生了堿基G向堿基C的錯義突變，從而導致其翻譯產物第145位上的氨基酸由谷氨酸轉變為谷氨酰胺，Slim等[20]通過體外研究表明rs5516所引起的表達產物氨基酸替換并不會引起緩激肽釋放酶活性的改變，但Jiang等[8]也推測rs5516多態性可能與其他有功能的突變位點相互作用從而影響KLK-1基因的表達。目前針對rs5516多態性的研究主要集中于大動脈瘤、動脈粥樣硬化、高血壓及降壓藥物反應性等方面[8，13，21]，尚無針對rs5516多態性與血脂方面的研究，而由上述理論我們可以推斷KLK-1基因上的rs5516位點多態性可能與血脂代謝相關，因此本文就這一問題進行了探索。

從結果中我們可以看出，rs5516位點CC基因型在病例組中的頻率要低于對照組，且這種差異有統計學意義，而C等位基因頻率卻在病例組與對照組之間無顯著性差異；在相關性分析中，在校正了年齡、性別、飲酒、吸煙、BMI等因素后，亦未發現CC基因型或C等位基因與血脂異常有明顯相關。因為人體血脂水平與多種因素相關，除遺傳背景可影響血脂代謝外，飲食、運動、不良嗜好等都會使血脂水平產生不同程度的偏差[22-23]，因此我們認為校正了各種可能對血脂水平產生影響的因素后的相關性分析的結果更有代表性，即在整體人群中，未發現rs5516位點多態性與血脂異常的相關性。

以往研究表明，rs5516位點可能與原發性高血壓的發生、發展相關，并且可能影響厄貝沙坦的降壓作用[8，13]。而我們的入選對象中并未剔除高血壓患者，因此，為了排除病例組與對照組中由于高血壓患者分布不同而對結果產生的影響，我們進一步按是否患高血壓進行亞組分析。在高血壓亞組與非高血壓亞組中，均未發現rs5516位點多態性與血脂異常有明顯相關。

血脂代謝調控機制復雜，且甘油三酯、膽固醇的代謝途徑也不盡相同，而血脂異常為包含多種血脂指標異常情況的總稱，無法具體反映單個血脂指標與目標SNP的關系，因此我們猜測rs5516是否可能單獨影響某種類型的血脂代謝。但在rs5516與各類型高脂血癥與各項血脂指標水平的相關性分析中，我們仍未發現其與血脂代謝的相關性。

由上，雖然機制上講rs5516多態性可能會通過影響胰島素作用進而影響血脂代謝，但根據本次研究結果分析，尚不能認為rs5516位點多態性與血脂異常及血脂水平相關。產生這種與理論不符的原因我們分析如下：①緩激肽與胰島素敏感性的關系各個研究的結果較為一致，但不同研究之間針對KLK-1基因改變與胰島素抵抗的聯系卻存在分歧。這可能是因為在病理狀態下，除緩激肽釋放酶之外，其他可以催化產生緩激肽的酶也被激活，使得KLK-1基因表達生成的緩激肽釋放酶并不是唯一甚至主要生成緩激肽的途徑；此外，緩激肽釋放酶發揮的具體作用還與腎素-血管緊張素-醛固酮系統以及瘦素等有著復雜的聯系[24-25]。這些都使得疾病狀態下KLK-1基因改變對于緩激肽生成的影響變得不甚明確，進而難以準確推斷對胰島素敏感性的具體作用。②如前所述，rs5516多態性是否會引起緩激肽釋放酶活性改變或對下游通路產生影響尚需進一步探索。③本次研究在保證入選對象性別、年齡匹配的情況下，收集了盡可能大的樣本量進行分析、對比，但更大樣本量的研究將進一步提高檢驗效能，使可能作用較為微弱的SNP對血脂代謝的影響可以更明顯表現出來。④血脂代謝受多種因素影響，盡管我們研究中已納入了多種可能對血脂代謝產生影響的因素作為協變量進行分析，但性激素水平、運動情況等可以影響血脂水平的其他環境因素并未納入回歸方程進行分析，這可能導致研究結果在一定程度上存在誤差。⑤血脂異常是遺傳因素與環境因素共同作用的結果，此外，同一基因上不同位點或不同基因間的交互作用也都有可能對血脂代謝產生影響，因此開展環境與基因之間及不同基因之間相互作用的分析將對進一步完善血脂異常的發病機制具有重要意義。

綜上所述，我們在較大樣本人群中探索了緩激肽釋放酶基因-1 rs5516多態性與血脂異常及血脂水平的相關性，尚不能推定rs5516與血脂異常及血脂水平相關。由于血脂代謝調控復雜，參與因素較多，因此未來除需在更大樣本人群中進行高質量的研究外，探索環境-基因及基因-基因之間的相互作用及開展針對KLK-1基因與胰島素抵抗及血脂代謝關系的基礎研究將對進一步闡明血脂代謝紊亂的發生、發展機制有重要意義。