高致病性禽流感監測預警模式的建立與應用

莫昆

（云南省文山州動物疫病預防控制中心 663000）

1 背景及目的意義

高致病性禽流感是由A型流行性感冒病毒引起的一種禽類（家禽和野禽）傳染病，可以直接感染人類，并造成死亡。至今發現能直接感染人的禽流感病毒亞型有：H5N1、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H9N2和H7N9亞型。其中，高致病性禽流感H5N1亞型和2013年3月在人體上首次發現的新禽流感H7N9亞型尤為引人關注，不僅造成人類傷亡，同時重創了家禽養殖業。2017年6月，云南省文山州首次出現了4例人感染高致病性禽流感H7N9亞型病例，導致全州人民群眾生命財產安全和公共衛生安全受到嚴重威脅，同時也造成社會的恐慌和家禽養殖業的重大損失，2017年全州存欄家禽1404.4萬羽，大部分是以千家萬戶散養為主的生產方式，普遍存在養殖設備簡陋、技術落后等問題，不具備科學防控禽流感的預警能力，一旦發生疫病極易造成流行和蔓延，從而引發重大的經濟損失和人群危害。再者，文山州地處邊疆，與越南邊境線長達438km，境外疫情復雜而且高發，境外疫病傳入風險較高，針對文山州高致病性禽流感防控的嚴峻形勢，文山州動物疫病預防控制中心在云南省動物疫病預防控制中心及文山州農業局的領導和支持下，開展了文山州高致病性禽流感監測預警模式的研究，以努力確保不發生區域性重大動物疫病和不發生重大畜產品安全事件為目標，圍繞建立和提高全州禽流感科學防控預警能力，提高邊境沿線防疫屏障的疫情防堵能力為核心任務，以實現“防風險、保安全、促發展”為總體目標任務。項目主要實施在全州邊境地區、養殖密集區、老疫區、候鳥遷徙或棲息地等高風險地區，依托具備資質的縣級獸醫實驗室5個，設立禽流感疫情監測網點52個，引進分子生物學檢驗新技術，配備相關設備，建立文山州第一個禽流感等疫病的病原學監測預警的分子生物學檢測（PCR）實驗室，承擔全州疫情監測、上報、流行病學分析等關鍵技術，構建了文山州禽流感監測預警體系，并成功控制和處置了2017年H7N9亞型流感疫情。

2 實施的內容

（1）分子生物學檢測室的建設。

（2）建立高致病性禽流感分子生物學檢測方法（以下簡稱PCR檢測）。

（3）設置監測點，建設高致病性禽流感監測網絡。

（4）構建高致病性禽流感監測預警模式。

（5）運用監測預警模式開展高致病性禽流感監測預警。

3 項目實施的技術路線、方法步驟及保障措施

3.1 技術路線

3.2 方法步驟

3.2.1 PCR檢測室的建設

2016年起，為提高動物疫病防控能力，文山州動物疫病預防控制中心積極籌措資金進行PCR檢測室的建設。

3.2.2 設置監測點，確立監測方案

根據HACCP危害分析和關鍵控制點原理，結合文山州實際，科學設置文山州高致病性禽流感監測點，并制定監測方案。

3.2.3 建立高致病性禽流感PCR檢測方法

PCR檢測技術的基本原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。檢測步驟包括病毒核酸提取、PCR擴增、凝膠電泳、成像。

（1）樣品采集：把采集的咽喉、泄殖腔、環境、運輸工具棉拭子分裝在盛有保存液的2ml離心管中密封，認真填寫采樣表，于采樣后20d內派專人專車運送至獸醫實驗室。

（2）病毒核酸提取，采用AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒。①收集200μl樣品，轉入1.5ml離心管中；②加200μl Buffer V-L（病毒裂解液），漩渦振蕩混合均勻，靜置5分鐘；③加75μl Buffer V-N（蛋白去除液），漩渦振蕩混合均勻，12000×g離心5min；④將上清轉移到新的2ml離心管中，加300μl異丙醇（1%冰乙酸），上下倒置6～8次，混合均勻；⑤將制備管置于2ml離心管中，取步驟④中的混合液移入制備管中，6000×g離心1min；⑥棄濾液，將制備管置回到2ml離心管中，加500μl Buffer W1A（洗滌液），室溫靜置1min，12000×g離心1min；⑦棄濾液，將制備管置回到2ml離心管中，加800μl Buffer W2（去鹽液），12000×g離心1min；⑧將制備管置回到2ml離心管中，12000×g離心1min；⑨將制備管置于潔凈的1.5ml離心管中，在制備管膜中央加40～60μl Buffer TE,室溫靜置1min，12000×g離心1min洗脫DNA/RNA。

（3）PCR擴增，引物由云南省動物疫病預防控制中心提供。

凝膠電泳。①凝膠制作：將1.2g西班牙瓊脂糖加入120ml 1×TAE電泳緩沖液中，搖勻，在微波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解，加入6μl花青素（體外染色劑），待瓊脂糖溶液冷卻至60℃左右將其倒入事先準備好的膠板中，室溫冷卻凝固，完全凝固后將凝膠置入電泳槽中，加入1×TAE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠1～2mm，小心垂直向上拔出梳子；②上樣：用移液器吸取8μl擴增產物與6×loading buffer混勻后小心加入凝膠中的點樣孔，吸取3μl Marker 2000加入另一點樣孔；③電泳：打開電泳儀開關，由于DNA分子在堿性緩沖液中帶負電荷，在外加電場的作用下將向正極移動，電泳約20～35min。

成像：將電泳后的凝膠置于凝膠成像儀，觀察并記錄實驗結果。

3.2.4 構建高致病性禽流感監測預警模式

以監測點為基礎，依托PCR檢測室，運用樣品采集、PCR檢測、免疫抗體檢測、流行病學調查等方法，認真開展高致病性禽流感監測，及時分析文山州高致病性禽流感分布規律，建立科學有效、切合文山州實際的高致病性禽流感監測預警模式。

3.2.5 開展高致病性禽流感PCR檢測

每月開展一次活禽交易市場高致病性禽流感A型檢測工作。檢測出的陽性樣品派出專人專車送省動物疫病預防控制中心確認并定型。

3.2.6 開展高致病性禽流感免疫抗體檢測

為準確評估高致病性禽流感免疫效果發現，高致病性禽流感免疫薄弱點，及時排除疫情隱患，采用定期和緊急兩種方式進行高致病性禽流感免疫抗體檢測，定期檢測采用集中檢測和常規檢測相結合的方法開展檢測，集中檢測每年開展2次，主要對文山州春、秋兩防免疫效果進行評估，常規檢測每月開展1次，主要對規模養殖場的免疫效果進行評估，緊急檢測主要為處置疑似高致病性禽流感疫情提供科學依據。

3.2.7 開展流行病學調查

通過調查禽流感在文山州的分布及危害程度來制定切合文山州實際的科學有效的防控措施。在人口密集、規模養殖集中的文山市和邊境通道多，邊民互市活躍的麻栗坡縣、富寧縣的重點區域，選擇規模養殖場和活禽交易市場進行流行病學調查和采集樣品，通過定期、連續采集調查點中的相關數據，為疫情分析評估提供信息。

3.2.8 分析文山州高致病性禽流感分布規律

根據長期檢測結果分析，文山州家禽所感染的高致病性禽流感亞型，以及各種亞型在時間、空間的分布規律。

3.3 保障措施

3.3.1 成立課題實施小組

為保證項目順利完成，成立了項目實施小組，討論制定實施方案和技術路線，關鍵技術研究，各環節的試驗設計、經費使用、進度安排等。

3.3.2 經費保證

為保障項目的順利實施，共籌措180萬元資金投入該項目。

4 項目實施結果

4.1 建成一個PCR檢測室

PCR檢測室于2017年9月建成并投入使用。PCR檢測室內設試劑準備區、標本制備區、擴增區、產物分析區4個功能區，配備梯度PCR儀、電泳儀、水平電泳槽、凝膠成像系統、臺式多功能離心機、生物安全柜等24臺套儀器設備，可開展禽流感、雞新城疫等病毒核酸檢測。

4.2 設立52個監測點

結合文山州實際，設置了以文山市城區活禽交易市場為主、各縣城區活禽交易市場為輔、兼顧規模養殖場的監測點，目前，文山州共設立52個監測點。

4.3 完成高致病性禽流感PCR檢測方法的建立工作

2017年8月，由云南省省動物疫病預防控制中心提供盲樣，并派出技術人員到現場指導，經省、州技術人員多次試驗驗證，最終建立了適合文山州動物疫病預防控制中心獸醫實驗室PCR檢測室實際的高致病性禽流感PCR檢測方法，確保了檢測的準確性、可靠性。

4.4 建立了科學的高致病性禽流感監測預警模式

（1）是將集中監測和常規監測相結合、常規監測與應急監測相結合、抗體監測和病原監測相結合、實驗室監測與流行病學調查相結合，認真分析、評估疫情發生風險，預測疫情流行態勢，及時獲得疫情預警信息。

（2）是突出加強對邊境地區、州府所在地、縣市城區所在地、養殖密集區的監測，及時發現和掌握重大動物疫情隱患，嚴格疫情報告和診斷。

（3）是增加監測比例、加大監測力度，及時匯總分析監測結果，全面評估發生疫情的風險，力求準確預測疫情發生和流行的態勢，科學指導防控工作。

4.5 高致病性禽流感監測預警模式的應用

4.5.1 定期開展監測與流行病調查

實驗室于2017年9月開始每月進行1次流感病原學檢測，并對檢測出高致性禽流感病原學陽性的監測場點開展流行病學調查。至2018年3月，共檢測禽流感病原學樣品4901份，檢出A型禽流感陽性樣品279份，檢出的陽性樣品經省級獸醫實驗室檢測確認，共有A型陽性248份，其中H5亞型8份。8份H5亞型流感涉及到文山、丘北兩個縣市的6個活禽交易市場，經調查未發現存在臨床癥狀的病禽。

2017年在文山州104個鄉鎮、638個村、1104個場戶開展了高致病性禽流感免疫效果定期檢測，抽檢了10414羽份血清樣品，合格8111份,合格率為77.89%，達到了群體免疫合格。

4.5.2 緊急開展監測與流行病學調查

2018年1月23日至2月4日，馬關縣動物疫病預防控制中心于在馬白鎮下寨村委會壩尾村進行禽流感流行病學調查采樣時，發現養雞戶田立寧家養殖場的雞發病快、死亡率高情況，經采樣送省、州進行PCR檢測，結果為禽流感H5N6陽性。為準確評估馬關縣馬白鎮高致病性禽流感免疫效果，文山州動物疫病預防控制中心派出專業技術人員，在馬關縣動物疫病預防控制中心緊急開展免疫抗體檢測，H5亞型免疫抗體檢測共檢測禽血清128份，合格69份（抗體效價5log2以上），合格率53.9%；H7亞型免疫抗體檢測共檢測禽血清120份，合格48份（抗體效價5log2以上），合格率40%。

表2 高致病性禽流感病原學檢測情況

圖1 文山州禽流感病原時間分布情況

圖2 文山州禽流感病原空間分布情況

4.5.3 初步分析出文山州高致病性禽流感的分布、流行規律

時間分布情況：從圖1中可以看出，文山州家禽間禽流感病原感染以低致病性禽流感H9N2亞型為主，2017年9月至2018年1月期間未檢測出高致病性禽流感陽性禽，2018年2月、3月分別檢測出1份、7份高致病性禽流感H5N1陽性禽，可分析出高致病性禽流感H5N1亞型在文山州有感染率上升的趨勢。

從圖2中可以看出，文山州家禽間禽流感病原感染主要分布于文山市、西疇縣、麻栗坡縣、丘北縣、廣南縣，其中以文山市家禽間帶毒率最高。

根據2017年9月到2018年3月的監測與調查結果分析，文山州禽流感病原感染以低致病性H9亞型流感為主，H9亞型流感每個月均有檢出，從區域上看，H9亞型流感主要分布在文山市、西疇縣、麻栗坡縣、丘北縣、廣南縣，污染面達到62.5%；2017年9月到12月文山州未檢測出高致病性禽流感陽性禽，2017年9月到2018年3月文山州均未檢測出H7亞型流感陽性禽，2018年1月到3月均檢出高致病性H5亞型流感陽性禽，從區域上看，H5亞型流感主要分布在文山市、丘北縣、馬頭縣，污染面達到37.5%。

4.5.4 及時上報監測預警報告

2017年9月到2018年3月，根據高致性禽流感的監測結果，向州農業局提供禽流感疫情監測預警報告4份，并指導各縣及時處置高致性禽流感病原學檢測陽性禽及其同群禽。

4.5.5 為科學防控高致病性禽流感提供保障

在文山州8縣推廣應用快速、敏感的高致病性禽流感的抗體監測方法，擴大了監測范圍的深度和廣度。各縣均能監測禽免疫后的免疫效果，根據免疫效果實施科學防控對策；并能及時掌握疫情動態，一旦發現疫情，盡早檢測做出準確診斷，嚴格實施有效防控措施，防止疫情擴散傳播，為當地養殖業發展提供技術保障。通過開展病原學PCR檢測，及時發現感染高致病性禽流感的家禽，發出監測預警，提出防控建議，為上級主管部門、各縣市做好疫情處置提供快速準確的防控依據。

5 創新點

5.1 文山州禽流感監測首次拓展到環境樣品

項目實施前，文山州的動物疫病監測樣品以血清為主，不能監測組織樣品和環境樣品，實施該項目后，文山州可以開展組織樣品和環境樣品的監測，填補了因畜禽死亡無法采集血清導致的監測工作開展不了的空白，進一步完善了文山州動物疫病監測體系。

5.2 文山州禽流感監測方法首次從血清學拓展到病原學檢測

血清學檢測過程中會經常出現假陽性反應、降低檢測的靈敏度、制備抗血清的時間較長且利用該方法一次只能檢測一種病毒。病原學檢測具有特異性高、靈敏度高、快速準確的優點，通常一次可以檢測多種病毒。文山州高致病性禽流感PCR檢測方法的建立和應用，監測方法由血清學轉變為病原學，確保了疫情的準確快速監測。

6 效益分析

6.1 經濟效益

（1）建立快速、敏感的高致病性禽流感病PCR檢測方法，降低監測成本，達到同類診斷生物制品的質量標準，監測成本降低50%。每年節約開支約20萬元左右。

（2）揭示高致病性禽流感病在文山州的傳染源及分布規律，建立實時、動態、有效的高致病性禽流感病監測預警，由于防控及時，降低了高致病性禽流感疫情發生概率。大大減少疫情發生而造成的經濟損失，以及撲滅疫情所投入的大量人力、財力、物力等支出，以文山州首次出現了4例人感染H7N9亞型流感病例為例，2017年6月，文山州因發生H7N9亞型流感疫情導致撲殺陽性及同群禽32903羽，按現行價50元/只計算，養殖戶損失1645150元（32903×50），因市場關閉、禁止活禽移動，導致165.95萬羽活禽推遲上市1個月（2017年文山州出欄禽1991.44萬羽，平均月出欄165.95萬羽），按每天每羽禽平均增加飼養成本0.2元計算，養殖戶損失995.7萬元，以上兩項共計讓養殖戶損失1160.22萬元。

（3）由于常規養殖風險會產生一定的畜禽死亡率，按降低死亡率2%計算，每年可減少家禽死亡28.01萬羽，減少經濟損失1400.50萬元。 （按2017年家禽存欄統計數1404.4萬羽，以現行價50元/羽計算）。

以上3項合計共2580.7萬元。

6.2 社會效益

（1）此項目的實施，為文山州防控禽流感提供病原學依據和有效的技術支撐，同時為其他重大動物疫病的監測預警提供借鑒和參照模式，提高了文山州防控重大動物疫病的整體實力和技術水平，促進畜牧業持續健康發展，保障公共衛生安全。

（2）通過項目的實施，開展流行病學調查、疫病監測、試驗示范、技術培訓等工作整體提高了獸醫隊伍業務素質和技能。