雄性不育東方百合轉錄組SSR信息分析及其分子標記開發

王 立，王有國，崔光芬，王祥寧，馬璐琳，段 青，杜文文，賈文杰*

(1.云南農業大學園林園藝學院，云南 昆明 650201；2.云南省農業科學院花卉研究所，云南 昆明 650205)

【研究意義】百合是享譽世界的著名球根花卉，擁有“球根花卉之王”的美譽，觀賞性極佳，隨著中國經濟的快速發展，人們對于百合鮮切花的需求也在日益劇增[1]。歐美國家自 20 世紀初即開展了百合育種工作，選育了大量優良的雜種系，其中東方百合雜種系是世界，也是中國最為流行的切花運用雜種系[2]。但是由于其花粉量大，往往在運用時容易污染衣物和環境，因此，培育雄性不育的無花粉百合一直是百合育種的重點方向[3]?！厩叭搜芯窟M展】如何開發相關分子標記技術來輔助實現無花粉百合的育種，是該項育種工作中的核心。目前利用分子標記進行的百合研究，主要集中在分析瀘定百合[4]、淡黃花百合[5]等不同群體的遺傳多樣性與親緣關系方面，運用的是常用的分子標記技術，主要有RAPD、ISSR、AFLP、SRAP[6]，也有基于EST序列開發百合SSR分子標記的研究[7]，而基于東方百合雄性不育系轉錄組測序結果開發SSR分子標記，并利用SSR標記進行無花粉百合遺傳多樣性分析的研究鮮有報道。【本研究的切入點】本研究在雄性不育東方百合轉錄組測序結果基礎上，開發SSR分子標記，并驗證其有效性。【擬解決的關鍵問題】為實現利用SSR分子標記技術進行輔助無花粉百合的育種和品種指紋圖譜構建奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 轉錄組數據來源

轉錄組數據來源于云南省農科院花卉所球根中心百合課題組2015年對東方百合高通量測序的結果。測序所用材料：東方百合可育系及其變異不育系造孢細胞期和四分體期花藥，每個時期取6朵花花藥[3]。分別提取2個時期的花藥RNA，測序時將2個時期的RNA分別等量混合后構建文庫，每個時期構建2個文庫。委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司對提取的RNA完成RNA-Seq測序，并通過Trinity方法組裝[8]。共得到135 483條Unigenes作為背景數據。

1.2 實驗材料及DNA提取

SSR分子標記可用性實驗材料為東方百合有花粉品種和云南省農業科學院選育的東方百合無花粉品系，采樣共計24份，每個株系取4～5片新鮮葉片，用變色硅膠干燥，室溫保存直到DNA提取。

總DNA的提取采用改良的CTAB法進行[4]，針對百合多糖較多，增加去蛋白質、多糖的步驟。選取DNA條帶清晰，亮度與Marker相當的用來篩選SSR引物。DNA母液稀釋后放入-20 ℃冰箱保存。

1.3 轉錄組 SSR 位點鑒別及 SSR引物設計

用Trinity軟件將轉錄組數據組裝，獲得轉錄本序列。組裝共得到222 365條Transcript和135 483條Unigene。采用MISA(1.0版，默認參數。)按照各個unit size的最少重復次數標準1-10，2-6，3-5，4-5，5-5，6-5對Unigene進行SSR檢測，詳見 http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html。找出SSR標記之后，采用Primer3(2.3.5版，默認參數)進行SSR引物設計[9]。

1.4 SSR引物篩選

SSR引物由精賽頓生物科技有限公司(云南)合成，從轉錄組SSR數據庫中隨機選取71對引物，其中包括各核苷酸重復類型。從供試百合材料中隨機挑選 24個個體對71對 SSR引物進行初步篩選(表1)。PCR擴增體系為10 μl：10×Buffer(Mg2+)1 μl；dNTP10 mmol/L 0.8 μl；上下游引物各 0.5 μl；Taq酶0.05 μl；DNA模板 0.5 μl，ddH2O 6.65 μl。擴增反應條件：95 ℃預變性5 min、95 ℃變性30 s、53 ℃(各引物有所不同)退火30 s 、72 ℃延伸30 s，反應34個循環，72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。然后將PCR產物用1 %瓊脂糖凝膠電泳進行多態性初篩，為了進一步確定引物的多態性，對能擴增出條帶的引物再進行2 %瓊脂糖凝膠電泳，采用花青素的方法顯色，以得到條帶多且亮的引物。

表1 供試百合材料

表2 百合轉錄組中不同SSR類型的數量以及頻率

注：c&c*均為復雜重復。

Note: c&c* are complex repeats.

1.5 數據統計

用SSR的出現頻率和SSR的平均分布距離來描述SSR。計算公式分別為SSR的出現頻率：fc(%)=c/n×100，其中n為無冗余EST數量，c為搜索到的SSR數量；SSR的平均分布距離：fN=N/c，其中，N為無冗余EST數量的總堿基數，c為搜索到的SSR數量。對瓊脂糖凝膠電泳結果的處理方法：采用人工讀帶的方式，在相同遷移的位置上，無帶的記為0，有帶的記為1，缺失的記為9，進行統計擴增結果，通過參考 Smith等[6]的方法計算多態信息含量(PIC)值。應用 POPGENE Version 1.31軟件對標記數據進行遺傳參數分析。

2 結果與分析

2.1 百合轉錄組中SSR 的分布及結構特點

轉錄組測序共獲得135 483條Unigenes，利用 MISA 軟件對獲得的Unigenes做SSR分析，發現其中11 649條Unigenes序列中包含有12 391個SSR位點，其中包含2個或2個以上SSR位點的序列有742條，占6.4 %。SSR的類型十分豐富，單核苷酸至六核苷酸重復類型共11 948個，同時還存在復雜重復類型443個。

單核苷酸所占比例最大，為 63.94 %；其次是二核苷酸、三核苷酸分別占總 SSR 的 20.65 %和 11.21 %；四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸重復類型比較少，分別占 0.46 %、0.10 %、0.06 %，復雜重復類型占3.58 %。轉錄組 SSR 重復單元的重復次數分布在 5～24次，單核苷酸重復單元主要在10次和10次以上，分別占總SSR的 26.10 %和37.84 %；二核苷酸至六核苷酸重復單元中，5次、6次重復所占比例最大，分別占7.66 %和9.13 %；通過分析，發現二核苷酸重復的次數主要在6、7、8 次；而三核苷酸的重復次數主要在 5、6、7 次。如表2所示。

2.2 轉錄組 SSR重復類型和頻率特征

百合轉錄組的SSR核苷酸基序類型十分豐富，其中以單核苷酸重復類型為主，單核苷酸主要重復次數為10次和10次以上，以A和T為主。A單核苷酸重復占4種單核苷酸重復的51.1 %，T單核苷酸重復占45.6 %，G單核苷酸重復占2.3 %，C單核苷酸重復占1.0 %，各單核苷酸詳細重復情況見圖1。

圖中縱坐標軸為同類核苷酸某一重復次數所占百分比The vertical axis in the figure means the percentage of a repetition of the same nucleotide圖1 單核苷酸重復類型分析Fig.1 The types of mononucleotide repetition

二核苷酸主要以 AT/AT、TA/TA、AG/CT、CT/AG、GA/TC、TC/GA為主，其中，GA/TC所占比例最大，達到 4.70 %，AT/AT占2.59 %，AG/CT 占 3.28 %；三核苷酸重復的主要類型較二核苷酸的類型多，以 GGC/GCC、GAG/CTC、GGA/TCC為主，GGC/GCC占0.68 %，其次是GAG/CTC占0.65 %；四、五核苷酸基序類型較二、三核苷酸基序類型少，TAAA/TTTA、CCCA/TGGG、GTCCG/CGGAC是最主要的幾個類型，但所占比重低。詳細SSR重復信息如表 3所示。

表3 SSR中二核苷酸和三核苷酸重復基元類型的數量及頻率

續表3 Continued table 3

重復單元類型Repeat motifsSSR重復基元類型的數量(個)The number of SSR repeat motifs5次重復6次重復7次重復8次重復9次重復10次重復>10次重復合計頻率(%)FrequencyCTC/GAG251451000450.36TG/CAG13210000160.13CTT/AAG14710000220.18GAA/TTC11820000210.17GAC/GTC410100060.05GAG/CTC522260000800.65GAT/ATC13110000150.12GCA/TGC15410000200.16GCC/GGC37691000530.43GCG/CGC251481000480.39GCT/AGC10421000170.14GGA/TCC481561000700.56GGC/GCC5517120000840.68GGT/ACC281130000420.34GTC/GAC410000050.04GTG/CAC13550000230.19GTT/AAC100000010.01TAA/TTA9661000220.18TAC/GTA010000010.01TAG/CTA100000010.01TAT/ATA24840000360.29TCA/TGA800000080.06TCC/GGA 21 221000260.21TCG/CGA 5 10000060.05TCT/AGA 13 021000160.13TGA/TCA 14 700000210.17TGC/GCA 12 320000170.14TGG/CCA 20 1031000340.27TTA/TAA 24 1090000430.35TTC/GAA 15 101000170.14TTG/CAA 4 20000060.05總計 8891123662382359393140394831.86百分比(%)7.179.065.343.082.903.171.1331.86

2.3 SSR引物的有效性驗證

隨機選取71對引物，其中包括單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸及六核苷酸等6種重復基元的SSR位點進行引物有效性驗證。以東方百合材料的24個樣品進行PCR擴增，篩選。其中22對引物能擴增出比較理想的產物，有效率為30.99 %。這說明利用東方百合花藥EST序列開發的SSR引物是高效可行的。圖2為部分引物在24份東方百合樣品中擴增的情況。

2.4 SSR引物評價

在71對隨機選取的SSR引物中，22對能夠成功擴增出條帶，有效率為30.99 %。利用驗證的22對引物對24份東方百合材料進行擴增及多態性的評價，22對SSR引物在東方百合中表現出多態性，共獲得了108個等位基因，分子標記中等位基因最多為10，最少為3，平均等位基因數5個，其中93017，191987，201703和 960002 4個引物的等位基因數分別是10，8，7，5個。觀望雜合度的范圍介于0.0154～0.4514，均值0.1977，期望雜合度的范圍介于0.1547～0.8471，均值0.4533。22個位點的PIC值變化范圍在0.1254～0.9248，平均值在0.5048，其中，高度多態的SSR分子標記有11對(PIC≥0.5)，表4為22對引物的多態性擴增情況。

圖2 部分SSR引物PCR擴增結果Fig.2 PCR amplification results of some SSR primers

表4 百合22個SSRs 標記的特征

續表4 Continued table 4

引物編號Primer No.SSR 基序重復Repeat motif上、下游引物序列Primer sequence 5’-3’Tm(℃)等位基因數Na觀測雜合度Ho期望雜合度He多態信息含量PIC203915(CACTGC)13F:TGCCAACATTCTCCGCAGATR:GTGTTGGCAAAGGCAGTGTT6050.42580.33250.5149202350(CCTGCC)8F:GAAAGACCCCTGGGACATGGR:AGACAAGCTCGGGGTTCTTG6040.45140.58140.3269188282(CCGAGC)5F:CCCAAAATGCCCTTCCTCCTR:TGTTTCGAGGGAGTGAACGG6040.21560.21440.3547206853(GGGTG)5F:AGGTGTTCGAGCTTGGGTTCR:AGATTCTCTCAAACGCGGCA6040.15420.36540.1254220620(GTCCG)5F:ACCTAACGGAGCAATGCACAR:GCAAAGCCTGGACGAGTTTC6050.01980.21590.6559203915(CACTGC)13F:TGCCAACATTCTCCGCAGATR:GAGTGTTGGCAAAGGCAGTG6040.24870.44580.4225202620(GTCCG)5F:ACCTAACGGAGCAATGCACAR:GACGGGACAAGCGGACTTAT6050.03650.15470.5874193722(GGGAG)5F:AGGGAAAGGACAGGCTCTCAR:AGTCCTGCGGTGAAGGAAAT6040.24780.32650.2164平均值///50.19770.45330.5048

3 討 論

隨著高通量測序技術的迅猛發展，通過轉錄組測序來開發EST-SSR引物的成本大為降低，對于類似百合這樣由于基因組巨大而缺乏基因組信息的物種，該技術提供了前所未有的機遇，已在許多植物中得到了廣泛的應用，如榧樹[10]，云南松[11]，西紅花[12]，印度南瓜[13]，南方紅豆杉[14]，燈盞花[15]等。大量研究工作表明，利用轉錄組數據可以挖掘和開發出豐富的SSR 標記[16]。

本研究對東方百合可育系及其變異雄性不育系2個不同發育時期的百合花藥進行轉錄組測序，共組裝得到222 365條Transcript和135 483條Unigene。利用MISA程序對篩選得到的1 Kb 以上的Unigene做SSR位點搜索，共獲得12 391個SSR位點。SSR位點發生頻率為9.14 %，高于菊芋(8.64 %)[17]、魚腥草(7.51 %)[18]、云南松(3.07 %)[11]等植物，低于西紅花(18.73 %)[12]。表明東方百合雄性不育系轉錄組中SSR數量相當豐富。

通過對基于東方百合雄性不育系轉錄組開發的SSR重復基元分析發現，該SSR分子標記的重復基元種類繁多，有單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸以及復雜重復基元等。而重復基元主要集中在單核苷酸、二核苷酸和三核苷酸重復，其中以單核苷酸重復最多，這與榧樹[18]的SSR分布類型極為相似、而與印度南瓜[13]、菊芋[17]、云南松[11]等植物多以二核苷酸、三核苷酸重復類型為主的SSR分布類型有所不同，說明東方百合SSR重復基元與其他物種的情況存在相似性，同時也存在一定的差異性。與杜方[19]等研究者基于百合不同器官EST開發的SSR多以二核苷酸和三核苷酸重復為主也有所不同，說明基于同一種植物不同器官組織轉錄組測序結果開發的SSR分布類型也有所不同。22對可擴增產物的SSR引物中，各對SSR等位基因多，多態信息含量PIC值高，說明SSR引物表現穩定可重復的多態性。

4 結 論

本研究成功篩選出22 對多態性較高、條帶清晰、穩定性好的引物。隨機對24種不同來源的東方百合可育品種及雄性不育系初篩的引物進行多態性驗證分析，結果顯示在22對SSR引物中，引物表現穩定可重復的多態性，各個位點的等位基因介于3～8個，平均等位基因數5個，多態信息含量PIC、觀測雜合度Ho、期望雜合度He的平均值分別是0.5048，0.1977和0.4533。研究表明通過對東方百合雄性不育系轉錄組分析可獲得較高頻率的SSR位點且類型豐富。將為東方百合雄性不育分子標記輔助育種和功能基因的挖掘等奠定基礎，同時對東方百合分子標記類型、遺傳資源評價、繪制遺傳圖譜、實現特定性狀的輔助選擇和進行比較基因組學研究也有重要意義。