硫酸銅和水楊酸對青稞生理生化指標的影響

張 麗，喬 楓

(青海師范大學生命科學學院 青藏高原資源與環境教育部重點實驗室，青海 西寧 810008)

【研究意義】硫酸銅脅迫是主要非生物脅迫類型之一[1]。銅(Cu)作為高等植物生長發育過程中的必需元素，是細胞色C氧化酶、酪氨酸酶、賴氨酸氧化酶，多巴胺β羥化酶等多種酶所必需的組分[2-3]，在作物的生長狀況、產量和品質方面發揮著重要作用。在植物體內，銅以銅鋅超氧化物歧化酶的形式對植物體的光合作用和呼吸作用進行調控；器官機能下降甚至病變等是機體缺少銅元素的病癥[4]；過量的銅在植物體內聚集，使植物體中的葉綠體酶失活，葉綠體分解加快，植物的光合作用、呼吸作用、代謝作用受到抑制，導致植株生長受阻[5]；銅含量過高還可以使植物體的細胞膜透性增大，可溶性物質外滲，電導率增大，造成植物滲透脅迫和離子脅迫，損傷類囊體膜，使植物失去綠色，影響亞硝酸還原酶活性，從而導致植物對N的吸收受阻[6]；并且植物的細胞組分還會受到破壞，使其細胞出現失水現象，改變了正常細胞的生理生化代謝，對其造成嚴重傷害，甚至導致植物最終死亡[7-8]。近年來工業污染愈加嚴重，環境中銅離子的含量急劇上升，過量的銅不但使農作物中金屬含量超標，使其抗逆性降低，而且還可以以食物的方式進入人體，通過食物鏈危害人類的身體健康[9]。【前人研究進展】水楊酸(SA)又名鄰羥基苯甲酸，一種簡單的酚類化合物，是細胞內的信號傳遞分子，是原核生物和真核生物所產生的次生代謝產物，在逆境條件下，可作為植物抗逆作用的重要信號和調節生理作用的重要因子，被認為是一種新型植物激素，對植物抗鹽、抗病、抗熱、抗旱、抗寒和耐重金屬性等逆境過程具有重要作用[10-13]。研究發現，用適宜濃度的SA處理種子，種子會加快萌發和生長[14-16]。水楊酸還可用于皮膚疾病治療[17]。青稞(Hordeumvulgare)作為禾本科一類適應性強的高原谷類作物，具有耐高寒、生長周期短、產量高等特點，主要生長于我國西北、西南，特別是青海、西藏等地，是青藏高原地區最主要的糧食作物[18-19]，而且是唯一可以在海拔4500 m以上的高寒地帶正常成熟的農作物。早在新石器時期我國就有青稞栽培的記錄，青藏高原地區青稞的栽培歷史也有3500年[18]。青稞具有極其豐富的食用和藥用價值，其高含蛋白質、高纖維和豐富的維生素，低含脂肪、糖等特點，在食品和醫療保健方面的得到了應用[20]。《本草拾遺》對于青稞除濕益氣、止瀉、強筋力的功效進行了記載。【本研究切入點】本文研究硫酸銅、水楊酸脅迫對青稞生理、生化響應及抗性機理，從生理生化的角度揭示硫酸銅、水楊酸脅迫對青稞的生理毒性。雖然人們對重金屬和有機酸脅迫有一定的了解[21-23]，但重金屬和有機酸對于青稞的影響研究較少，探究水楊酸和硫酸銅處理對青稞的形態結構和代謝特點的影響。【擬解決的關鍵問題】可為進一步研究逆境條件下青稞的生長狀況和幼苗中酶活性的變化過程奠定基礎，進而對其調控機制進行研究。

表1 實驗處理

1 材料與方法

1.1 供試材料

實驗材料是由青海大學農林科學院作物所提供的青稞(北青6號)。水楊酸，由鄭州翰碩化工原料有限公司生產，用去離子水配制成100 μm/L。硫酸銅(CuSO4·5H2O)，由上海開諾醫藥科技有限公司生產，用去離子水配制成 600 μM/L母液，試驗時稀釋成所需質量濃度。

1.2 實驗處理

選顆粒飽滿的北青6號種子，用自來水沖洗數次，用75 %的乙醇溶液消毒10 min，蒸餾水沖洗3次，將種子放入鋪有2層濾紙的直徑20 cm的培養皿內，每個培養皿放50粒。并按SA、CuSO4單因素與SA+CuSO4雙因素等不同脅迫條件，設置6個不同強度等級的脅迫條件，待青稞種子長出2片子葉開始處理，期間及時用6個處理(表1)培養，分別編號，每個處理重復3次，持續10 d后，開始測青稞幼苗生理指標。

1.3 測定指標和方法

用比色法 CAT活性[24]；用愈創木酚法測定過氧化物酶POD活性[25]；用硫代巴比妥酸(TBA)法測定丙二醛MDA的含量[26]；用氮藍四唑法測定超氧化物歧化酶SOD活性[27]；抗壞血酸過氧化物酶APX活性測定參照Nakano和Asada的方法[28]。

2 結果與分析

2.1 青稞過氧化氫酶活性的影響

SA、CuSO4單因素與SA+CuSO4雙因素等不同脅迫條件對青稞CAT酶活性的影響見圖1。

與對照組處理1相比，處理2(100 μM SA)、處理5(600 μM CuSO4)情況下青稞幼苗CAT酶的活性都明顯升高(P< 0.05)，而處理3(20 μM CuSO4)、處理4(100 μM SA+150 μM CuSO4)和處理6(100 μM SA+600 μM CuSO4)情況下青稞幼苗的CAT活性無顯著性差異。相比于硫酸銅單獨處理條件，在水楊酸和硫酸銅混合處理下青稞幼苗CAT活性有所下降但不明顯，可能是水楊酸和硫酸銅混合處理時，其中水楊酸可緩解硫酸銅的毒害作用，從而抑制了青稞幼苗CAT活性的升高 。

圖中小寫字母不同表示差異具有統計學意義(P<0.05)；圖中橫坐標表示：處理1：CK，處理2：100 μM SA，處理3：150 μM CuSO4，處理4：100 μM SA+150 μM CuSO4，處理5：600 μM CuSO4，處理6：100 μM SA+600 μM CuSO4，下同圖1 CuSO4和SA處理對青稞CAT活性的影響Fig.1 Effects of CuSO4 and SA on the activity of highland barley CAT

2.2 CuSO4和SA處理對青稞過氧化物酶活性的影響

隨著Cu2+和SA質量濃度增大青稞幼苗中POD活性逐漸升高(圖2)，并且處理4(100 μM SA+150 μM CuSO4)、處理5(600 μM CuSO4)、處理6(100 μM SA+600 μM CuSO4)下，POD酶活性顯著增高(P<0.05)，分別提高了70.62 %、84.17 %、94.8 %。

2.3 CuSO4和SA處理對青稞丙二醛活性的影響

SA、CuSO4單因素與SA+CuSO4雙因素等不同脅迫條件對青稞MDA活性的影響見圖3。

圖中小寫字母不同表示差異具有統計學意義(P<0.05)。圖中橫坐標表示，處理1： CK，處理2：100 μM SA，處理3：150 μM CuSO4，處理4：100 μM SA+150 μM CuSO4，處理5：600 μM CuSO4，處理6：100 μM SA+600 μM CuSO4圖2 CuSO4和SA處理對青稞POD活性的影響Fig.2 Effects of CuSO4 and SA on the activity of highland barley POD

圖3 CuSO4和SA處理對青稞MDA活性的影響Fig.3 Effects of CuSO4 and SA on the activity of highland barley MDA

與對照組相比，處理2(100 μM SA)、處理3(20 μM CuSO4)、處理4(100 μM SA+150 μM CuSO4)下，青稞幼苗中丙二醛的含量無顯著性差異；處理5(600 μM CuSO4)和處理6(100 μM SA+600 μM CuSO4)情況下的青稞幼苗中丙二醛的含量顯著升高(P<0.05)，分別升高了56.1 %和63.8 %，高的脅迫濃度增加MDA含量。

2.4 CuSO4和SA處理對青稞超氧化物歧化酶活性的影響

SA、CuSO4單因素與SA+CuSO4雙因素等不同脅迫條件對青稞SOD活性的影響見圖4。

SA、CuSO4單因素低濃度時，青稞葉片SOD含量的變化不明顯，但隨著脅迫濃度的增大，各脅迫組的SOD含量上升，其中處理4～6 SOD含量顯著上升(P<0.05)。

2.5 CuSO4和SA處理對青稞抗壞血酸過氧化物酶活性的影響

SA、CuSO4單因素與SA+CuSO4雙因素等不同脅迫條件對青稞SOD活性的影響見圖5。

與CK組相比，SA、CuSO4單因素與SA+CuSO4雙因素脅迫對青稞葉片APX活性的影響不顯著。

2.6 CuSO4和SA處理對青稞葉綠素含量的影響

SA、CuSO4單因素與SA+CuSO4雙因素等不同脅迫條件對青稞葉綠素含量的影響見圖6。

圖4 CuSO4和SA處理對青稞SOD活性的影響Fig.4 Effects of CuSO4 and SA on the activity of highland barley SOD

圖5 CuSO4和SA處理對青稞APX活性的影響Fig.5 Effects of CuSO4 and SA on the activity of highland barley APX

圖6 CuSO4和SA處理對青稞幼苗葉綠素含量的影響Fig.6 Effect of CuSO4 and SA on chlorophyll content of highland barley

無論是SA、CuSO4單因素與SA+CuSO4復合脅迫，各脅迫條件下北青6號葉片中的葉綠素含量，均隨重金屬和有機酸脅迫濃度的增大而呈不斷下降的趨勢，脅迫濃度與葉綠素含量之間均呈顯著負相關性。

2.7 CuSO4和SA處理對青稞發芽率，株高，根長的影響

SA、CuSO4單因素與SA+CuSO4雙因素等不同脅迫條件對青稞發芽率，株高，根長的影響分別見圖7～9。

北青6號在單因素及其雙因素復合脅迫下，株高、根長均表現出明顯的毒害癥狀，其發芽率、株高、根長總體呈下降趨勢，說明SA或CuSO4單因素及其SA+CuSO4雙因素復合脅迫均能抑制北青6號的生長，并隨各脅迫濃度的升高其抑制作用也增大。

圖7 CuSO4和SA處理對青稞發芽率的影響Fig.7 Effect of CuSO4 and SA on the germination rate of highland barley

圖8 CuSO4和SA處理對青稞幼苗株高的影響Fig.8 Effects of CuSO4 and SA on the height of highland barley seedlings

圖9 CuSO4和SA處理對青稞根長的影響Fig.9 Effects of CuSO4 and SA on the root length of highland barley

由圖7～9可知，與對照組處理1相比，從處理3(100 μM SA)至處理6(100 μM SA+600 CuSO4)株高、根長基本呈下降趨勢，但沒有達到顯著性水平。由圖8可以看出，與CK相比處理3(20 μM CuSO4)至處理6(100 μM SA+600 μM CuSO4)，青稞幼苗的株高顯著降低(P<0.05)，分別降低了61.7 %、69.5 %、71 %、73.1 %。由圖9可以看出，與對照相比其中處理3(20 μM CuSO4)至處理6(100 μM SA +600 μM CuSO4)中青稞幼苗的根長顯著下降(P<0.05)，分別下降了95 %、91 %、99 %、96.5 %；并且在SA、CuSO4單因素與SA+CuSO4雙因素復合脅迫下，株高降低率比根長的降低率大，說明SA、CuSO4單因素與SA+CuSO4雙因素復合脅迫對株高的抑制作用比對根部的抑制作更強。但SA、CuSO4單因素與SA+CuSO4雙因素復合之間的差異顯著性并不高， 即SA、CuSO4單因素脅迫對青稞生長的抑制作用和復合脅迫的作用相似。

3 討 論

眾多研究表明，重金屬和有機酸對植物的脅迫作用主要表現在生長狀況、葉綠素含量及植物體內抗氧化酶活性變化等方面[29]；多立安等[30]對在金屬離子脅迫條件下黑麥草生長狀況進行研究時發現，重金屬離子對根系生長具有抑制作用，使其葉綠素含量降低。吳月燕[31]在2009年研究重金屬脅迫對5個常綠闊葉樹種生理生化特性的影響提出，不同濃度的重金屬處理下，SOD、POD和CAT的活性均呈現出先升后降的趨勢。張帆等[32]研究外源水楊酸誘導對番茄幼苗抗冷性的影響時發現，水楊酸能有效提高番茄幼苗的抗低溫能力,使其葉綠素、脯氨酸含量、SOD、POD、CAT活性升高,相對電導率、可溶性蛋白含量、MDA含量降低。本實驗研究結果表明，SOD、POD和CAT變化趨勢與前人研究不太相同，隨著CuSO4、SA單一及復合脅迫濃度的升高，抗氧化酶CAT、POD、SOD活性增加，可能是因為硫酸銅和SA的混合溶液產上了新的物質，對植物的生長發育影響較大。北青6號的株高、 根長、葉綠素含量等生理指標均出現下降的趨勢，說明CuSO4、SA單因素或其雙因素復合脅迫均能不同程度地抑制青稞的生長，且隨濃度的提高產生的抑制作用也增大。CuSO4、SA單因素或其雙因素復合脅迫導致青稞的葉綠素含量降低的原因可能是由于CuSO4、SA與相關酶作用，抑制葉綠素前體的合成，促進葉綠素分解或直接破壞葉綠體結構， 從而降低葉綠素含量說明，一些重金屬對某一生長指標的影響往往表現在低濃度具有促進作用,而高濃度又存在明顯的抑制效應。

當植物處于逆境時，反映細胞膜脂過氧化程度和植物對逆境條件反映的強弱的丙二醛(MDA)含量增加，導致膜脂過氧化，膜的功能和結構遭到破壞，對植物造成傷害。因此，在CuSO4、SA脅迫下，葉綠體內的氧活化成活性氧，對葉綠體結構和功能產生不同程度的傷害。 超氧化物歧化酶(SOD)在植物清除活化氧方面起到重要作用。CAT有清除體內氧自由基的作用。本研究表明，青稞對低濃度的CuSO4、SA脅迫環境具有一定的適應能力。探究水楊酸和硫酸銅脅迫下青稞種子根的生長狀況和酶活性的變化，可為進一步研究水楊酸和硫酸銅處理下青稞種子在逆境脅迫條件下的生理機制奠定基礎。