產阿扎霉素F菌株Streptomyces malaysiensis 種子培養條件研究

張 慶，白亭亭，李銘剛，施竹鳳，楊群輝，彭榮珍，楊明英，楊佩文，王家銀,趙黎明

(1.云南省農業科學院農業環境資源研究所，云南 昆明 650205；2.云南大學，云南 昆明 650091；3.云南省農業科學院農業經濟與信息研究所，云南 昆明 650205;4.四川省農業科學院，四川 成都 610066)

【研究意義】 阿扎霉素F系列化合物是從云南省寧蒗縣土壤樣品中分離篩選得到的一株鏈霉菌所產生的具有獨特大環內酯結構的抗生素，該抗生素具有廣譜的抗真菌活性，具有開發為新型殺菌劑的潛力[1]。前期試驗結果表明，菌種是從自然界中篩選的野生菌株，目標化合物產量較低，難以滿足工業化生產的需要。因此，需要通過改進生產菌株的種子質量，創造適合菌體生長的最佳條件，充分發揮菌種的生產潛力，從而實現提高目標化合物發酵產量的目的。【前人研究進展】在微生物發酵生產過程中，通過培養獲得質量優良的種子是整個發酵工藝的前提[2-3]。培養基組成(如碳源、氮源、磷酸鹽等的種類和濃度)和培養條件(如溫度、酸堿度、溶解氧等)是對菌體生長繁殖、產物的生物合成、產品的分離精制乃至產品的質量和產量都能直接或間接地產生影響的重要因素。通過優化培養基組成和培養條件，可實現提高菌株種子質量的目的[4-5]。Plackett-Burman(PB)試驗和響應面分析(Response Surface Analysis，RSA)試驗是優化培養基組成常用的方法。通過PB試驗，可以從多個考察因素中快速有效地篩選出主要因素，是RSA試驗的前提[6]。RSA試驗則是采用多元二次回歸方程的方法，擬合主要考察的各因素與其響應值之間的函數關系，通過對函數響應面和等高線的分析以及試驗指標的各因子水平及其交互作用分析，確定各考察因素最優參數的試驗方法[7-8]。【本研究的切入點】在菌株ECO-00002工業化發酵生產實踐中，菌株種子的優劣直接影響到菌株發酵周期和阿扎霉素F系列化合物的產量。因此，有必要進行種子培養基和培養條件篩選優化研究。【擬解決的關鍵問題】本研究擬通過菌株種子培養基和培養條件優化，提高菌體生物量，為后續發酵產物的形成打下基礎，指導工業化生產。

1 材料與方法

1.1 菌株

云南大學微生物研究所保藏菌種馬來西亞鏈霉菌S.malaysiensisECO-00002。

1.2 培養基

基礎培養基[9]：酵母膏4 g，葡萄糖4 g，麥芽膏5 g，復合維生素(維生素B11 mg，維生素B61 mg，核黃素1 mg，煙酸1 mg，苯丙氨酸1 mg，生物素1 mg，丙氨酸0.3 mg)，微量鹽(FeSO4·7H2O20 mg，MnCl2·2H2O 10 mg，ZnSO4·7H2O 10 mg)，瓊脂20 g，水1000 mL，pH 7.5，制作平板和試管斜面。液體種子培養基：葡萄糖14.5 g，酵母膏15 g，麥芽膏20 g，CaCO33 g，MgSO4·7H2O 1 g，MnSO4·4H2O 0.1 g，KH2PO40.2 g，水1000 mL，pH7.5。

PB試驗培養基和RSM試驗種子培養基：采用STATISTICA 6.0進行試驗設計，并配制相應培養基，培養基于1×105Pa下滅菌20 min。

1.3 PB和RSA試驗方法

采用PB試驗設計考察主要的碳氮源成分對種子生長的影響，篩選適宜的碳氮源；在此基礎上，采用RSA試驗優化適宜碳氮源的比例。具體方法：將供試菌株接種于斜面試管培養基上，然后置于28 ℃恒溫條件下培養120 h。再用滅菌蒸餾水洗下菌體，并按照10 % 的接種量接入裝有100 mL 種子培養基(PB培養基和RSA培養基)的500 mL 三角瓶中，并于28 ℃、200 r/min的搖床上振蕩培養48 h。待培養結束，種子液用濾紙過濾后，于80 ℃烘干至恒重，并稱取菌體生物量。

1.4 復合維生素、復合鹽和CaCO3的優化試驗方法

在確定種子生長適宜碳氮源的基礎上，優化種子培養基中的復合維生素(維生素B11 mg/L、維生素B61 mg/L、核黃素1 mg/L、煙酸1 mg/L、苯丙氨酸1 mg/L，生物素1 mg/L，丙氨酸0.3 mg/L)、復合鹽(MgSO4·7H2O 1.00 g/L、MnSO4·4H2O 0.10 g/L、KH2PO40.20 g/L)和CaCO3(3.00 g/L)的比例。各因素的比例分別按初始液體種子培養基中的比例設置添加與不添加2個處理，試驗方法和測定方法同上。

1.5 培養條件優化試驗方法

在培養基篩選優化的基礎上，進行起始pH、搖瓶裝液量對菌株生長的影響試驗。分別設置初始pH為4、5、6、7、8、9等6個梯度和種子瓶裝液量為80、100、120、140、160、180 mL/500 mL等6個梯度試驗，試驗方法和測定方法同上。

1.6 不同培養條件對種子生物量的影響試驗和方法

根據培養基篩選優化的試驗結果，配制種子培養基，并根據優化的培養條件，進行種子培養，考察優化前后菌株種子生長情況，試驗方法和測定方法同上。

2 結果與分析

2.1 PB試驗結果與分析

對種子培養基組成中的葡萄糖、酵母膏、麥芽膏、(NH4)2SO4、NaNO3等5個碳氮源因素進行篩選，每個因素設高低2個水平，實驗設計與結果如表1～2所示。回歸分析表明，葡萄糖、酵母膏以及麥芽膏是主要的影響因素，3者在大于95 %的概率水平上差異顯著，其它2個因素(NH4)2SO4和NaNO3在95 %的概率水平上差異不顯著，由此確定葡萄糖、酵母膏和麥芽膏為主要因素進行下一步實驗。

表1 種子培養基中的碳氮源篩選PB試驗設計與結果

表2 種子培養基中的碳氮源篩選統計分析結果

2.2 RSA試驗結果與分析

在PB試驗基礎上，以麥芽膏2.0 %為比例，對葡萄糖和酵母膏的配比進行優化，結果用STATISTICA 6.0進行統計分析，結果如表3～4和圖1所示。各因素之間有一定交互作用，二次方模型與上述結果的擬合較好(模型的R2>0.98)。模型為： mycelia cake=5.43624+0.11894 ×葡萄糖濃度(%)+3.12863×酵母膏濃度(%)-0.91677×葡萄糖濃度(%)2-1.42188×酵母膏濃度(%)2+1.50750×葡萄糖濃度(%)×酵母膏濃度(%)，各因素優化的比例：葡萄糖濃度1.45 %，酵母膏濃度1.50 %，麥芽膏2.00 %。

2.3 復合維生素、復合鹽和CaCO3的優化試驗結果與分析

在PB試驗和RSA試驗基礎上，設置添加與不添加2個處理，考察復合維生素、復合鹽和CaCO3對種子生物量的影響，試驗結果如表5所示。試驗結果表明，復合鹽和CaCO3對菌株生物量有較大影響，而復合維生素的影響不明顯。種子培養基中可以不加復合維生素，但必須加復合鹽和CaCO3。

2.4 培養條件優化試驗結果與分析

2.4.1 起始pH對種子生物量的影響 不同起始pH對菌株種子生物量的影響試驗結果如表6所示。從表6可以看出，當 pH<5時菌株生長較差，生物量低；當pH為7～8時，菌株生長較好，生物量最高，隨著pH持續升高，生物量反而下降。因此，選擇種子培養基的初始pH為7.5。

表3 RSA試驗設計與結果

表4 RSA試驗統計分析結果

2.4.2 裝液量對種子生物量的影響 不同種子瓶裝液量對菌株生物量的影響試驗結果如表7所示。試驗結果表明，在80、100、120、140、160、180 mL等6個梯度種子瓶裝液量試驗中，裝液量與菌體生物量呈反比，則隨著裝液量的增加，菌體生物量逐漸降低。但綜合考慮種子瓶的利用效率，500 mL三角瓶裝種子培養基的量選擇100～120 mL為適宜。

圖1 RSA試驗確定響應最大值Fig.1 The maximum response value determined by RSA test

項目Item復合維生素Multivitamin復合鹽Inorganic salt碳酸鈣CaCO3添加Added不添加Not added添加Added不添加Not added添加Added不添加Not added生物量(%)Biomass5.715.866.803.045.363.1148 h pH5.245.135.065.784.935.25

表6 起始pH對菌株種子生物量的影響

表7 種子瓶裝液量對菌株種子生物量的影響

2.5 不同培養條件對種子生物量的影響

以初始種子培養條件為對照，考察了優化的培養基和培養條件下菌株種子生長情況，試驗結果如表8所示。在優化的培養基和培養條件下，菌株生物量(菌絲體干重)由原來的4.09 g提高到8.91 g，提高率為117.70 %(P<0.01)。

3 討 論

3.1 培養基成分對種子質量的影響

在微生物發酵工業化生產中，培養生理狀態好、生長快、菌體生物量高、延滯期短的優良種子是獲得目標化合物高產的先決條件[10-12]。不同培養類型的微生物對營養元素(碳源、氮源、能源、無機鹽、生長因子等)的需求不同，需要根據所培養菌種對營養要素和生長條件的需求，進行優化試驗，才能獲得優良的菌株種子[13-15]。目前種子培養基優化試驗常用的方法有單因子試驗法、正交試驗法和響應面試驗法等多種方法。單因子試驗法主要確定單一因素對菌株生物量的影響，而不能研究各因素間的交互作用[16]。正交試驗法可以同時考察多個因素對菌株生物量的影響，既能同時考察多個因素對菌株生物量的影響，又能研究多個因素之間的交互作用，從而求得因素和響應值之間的回歸方程，試驗次數少、周期短，是優化種子培養基的一種有效辦法[17-19]。陳光義等通過對產環己酰亞胺的菌株種子培養基優化，目標化合物的產量比原始產量提高了10.7 %[9]。劉金國等采用單因素試驗和正交試驗，對鏈霉菌702的種子培養基和培養條件進行優化，目標活性化合物的生物效價提高了27.7 %[4]。本試驗采用 PB試驗法，從葡萄糖、酵母膏、麥芽膏、(NH4)2SO4、NaNO3等5個影響因素中，篩選出具有顯著影響的因素為葡萄糖、酵母膏和麥芽膏，進一步通過RSA試驗法確定了3 個因素的最優水平，菌株生物量比原始培養條件下提高了117.70 %，優化效果顯著，表明PB試驗法和RSM試驗法相結合，可以快速、有效地從多個因素中，篩選出主要的影響因素，確定其最優值。

表8 不同培養條件對菌株種子生物量的影響(X±SE)

3.2 種子培養條件對種子質量的影響

菌株種子的質量好壞是影響發酵工業化生產水平的重要因素，除營養條件外，種子生長條件也是決定其質量好壞的主要條件[20]。在種子培養過程中，保持菌株生長所需的最適溫度，則有利于菌體快速生長，從而可以縮短生長期。而pH值是微生物在一定環境條件下代謝活動的綜合指標，每一類微生物都有其最適的和能耐受的pH值范圍，它對菌體的生長也有較大影響。同時，良好的氧氣供應是好氧微生物生長最重要條件之一，裝液量直接決定微生物生長過程中獲得溶解氧量的高低。一定的轉速下，裝液量越少，微生物獲得的溶解氧越高，菌株生長越旺盛。培養時間的長短則是影響種子質量和濃度的另一個重要因素，種齡過長或過短，不但會延長發酵周期，而且會降低產量[21-22]。觀察供試株菌ECO0002種子生長過程可以發現，隨著菌體的生長，生物量不斷提高，到40 h時達到最大，之后隨著時間的延長，生物量變化不大。表明40 h時，菌株處于對數生長期中后期，作為種子液最為適宜。

4 結 論

阿扎霉素產生菌馬來西亞鏈霉菌ECO-00002種子生長的主要影響碳源為葡萄糖、酵母膏、麥芽膏，各因素的最大響應值為葡萄糖1.45 %，酵母膏1.50 %，麥芽膏2.00 %；無機鹽為CaCO33.00 g/L、MgSO4·7H2O 1.00 g/L、MnSO4·4H2O 0.10 g/L、KH2PO40.20 g/L，初始pH 7.50，裝液量100 mL/500 mL，培養溫度28 ℃，培養時間為200 r/min振蕩培養40 h。在優化的種子培養基和培養條件下，菌體生物量由原來的4.09 g提高到8.91 g，提高率為117.70 %，優化效果顯著。