江蘇鎮江地區水稻惡苗病菌分離鑒定與對咪鮮胺的抗性分析

周華飛，楊紅福，陳宏州，束兆林，姚克兵，莊義慶

(江蘇丘陵地區鎮江農業科學研究所，江蘇 句容 212400)

【研究意義】水稻惡苗病又名水稻徒長病，是亞洲、非洲和北美洲一種常見的水稻病害[1]。近些年由于旱育秧技術和粳稻品種的加速推廣，水稻惡苗病菌發病率呈現上升趨勢。【前人研究進展】水稻惡苗病菌可造成水稻產量上10 %～20 %的損失，嚴重時可達50 %，同時導致谷粒變褐等稻米品質下降[2]。1998年浙江永嘉惡苗病大面積爆發，最終統計面積約6500 hm2，損失最高達到產量的15 %。2005年黑龍江惡苗病暴發成災導致農戶直接經濟損失超過15萬元。近些年來江蘇省受該病的影響也在加大，2012年江蘇省揚州市水稻田部分田塊惡苗病發病率達到80 %，嚴重威脅水稻產量的安全[3]。在國外以水稻為主的糧食產區，水稻惡苗病帶來的威脅同樣與日俱增。2002年加利福尼亞統計水稻惡苗病的發病率達到80 %，造成的水稻產量損失達到30 %[4]。水稻惡苗病在韓國的水稻產區同樣造成了嚴重的損失[5]?！颈狙芯壳腥朦c】目前水稻惡苗病的防治主要依靠化學藥劑，常用藥劑為咪鮮胺，主要通過作用于麥角甾醇生物合成途徑來達到防治該病的目的[6]。近幾年咪鮮胺的田間藥效逐年下降，經檢測發現水稻惡苗病菌對咪鮮胺已產生一定的抗藥性，江蘇部分地區的抗藥性已經達到很高的水平[7]?！緮M解決的關鍵問題】對于近些年水稻惡苗病菌抗性的產生問題，本研究采集和分離鎮江地區98株水稻惡苗病菌，進行種屬鑒定，測定其對咪鮮胺的EC50值，檢測靶標位點cyp51A位點的突變情況，旨在為延緩和改良抗性產生提供一定的理論基礎和實踐依據。

1 材料與方法

1.1 供試藥劑和菌株

97 %咪鮮胺原藥為江蘇丘陵地區鎮江農業科學研究所植物保護研究室提供，使用甲醇配成2.0×103μg·mL-1母液待用。

供試的水稻惡苗病菌株采集于江蘇丘陵地區鎮江農業科學研究所實驗基地及周圍水稻產區，種植水稻品種主要為武運粳21號、運粳23號和運粳24號，鎮稻18號等等，種植區常年使用咪鮮胺及其復配制劑來防治水稻惡苗病[8]。

1.2 試驗方法

1.2.1 水稻惡苗病菌的分離鑒定 將采自于惡苗病發病田塊的晚期水稻植株接種于固體PDA培養基(馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，pH 7.0)[9]上，28 ℃條件下培養直至菌絲出現，進行單孢分離，將獲得的菌株編號保存。將分離的單孢水稻惡苗菌株接種于50 mL液體PDA培養基，在28 ℃條件下培養5～7 d，過濾獲取菌絲，烘干菌絲。使用真菌DNA提取試劑盒(EasyPure Genomic DNA Kit，北京全式金生物技術有限公司)提取上述水稻惡苗病菌總DNA，以真菌ITS通用引物(ITS1-5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，ITS4-5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)[10-13]進行PCR擴增，擴增片段大小為550 bp?？偡磻w系(50 μl)：DNA，2 μl；TaqBuffer，5 μl；dNTP，4 μl；Taq酶，1 μl；ITS，各1 μl；ddH2O，36 μl。反應條件：95 ℃，3 min；95 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，1 min，35 循環；72 ℃，10 min；10 ℃ 程序終止。PCR產物片段大小約為550 bp，經凝膠電泳檢測確認條帶后，送至上海生工生物工程公司進行測序。測序序列經NCBI-BLAST在線比對分析，使用MEGA 4系統發育進化樹軟件構建NJ進化樹，確定上述水稻惡苗病菌的種屬關系及優勢種群。

1.2.2 水稻惡苗病菌對咪鮮胺的EC50測定 以水稻惡苗病菌菌絲的生長速率為依據的菌絲生長速率法進行測定[14-15]。咪鮮胺原藥濃度梯度設置為0.001、0.01、0.1、1和10 μg·mL-1，不添加咪鮮胺藥劑的PDA平板作為空白對照CK。在每個平板中央處接種直徑為8 mm的水稻惡苗病菌菌碟，在28 ℃條件下培養直至CK處理平板水稻惡苗病菌菌絲鋪滿整個平板為止。采用十字交叉法測量平板中菌落直徑，根據下列公式計算咪鮮胺對水稻惡苗病菌的菌絲生長抑制率和EC50值。抑制率={(對照菌落直徑均值-處理菌落直徑均值)/(對照菌落直徑均值-接種菌餅直徑)}×100 %[16]。采用Excel 2013進行數據處理，分別計算藥劑對供試菌株菌絲生長抑制的EC50值。

根據陳夕軍等[7]確認的江蘇13個地區的水稻惡苗病菌對咪鮮胺的敏感性基線EC50為(0.00075±0.00003)μg·mL-1來確定江蘇鎮江地區水稻惡苗病菌對咪鮮胺抗性倍數(EC50/敏感性基線)，分為低抗(5～10倍)、中抗(10～100倍)和高抗水平(100倍以上)。

1.2.3 水稻惡苗病菌抗咪鮮胺脫甲基酶cyp51A突變位點檢測 以水稻惡苗病菌對咪鮮胺EC50大小為依據篩選出抗性和敏感最強的各2株菌株。接種上述4株水稻惡苗病菌于50 mL液體PDA培養基中，28 ℃條件下150 r/min搖培5～7 d，過濾收集菌絲，采用CTAB法提取4株病原菌的全基因組DNA。由NCBI檢索獲取水稻惡苗病菌cyp51A序列F.fujikuroiB14為靶標序列設計引物cyp51AF(5’-TGTTTCCACTCCTCTACTAC-3’)和cyp51AR(5’-AAGCCTTCCTG CGTTGCC-3’)，PCR擴增大小約為1500 bp的cyp51A片段?？偡磻w系(50 μl)：DNA，2 μl；TaqBuffer，5 μl；dNTP，4 μl；高保真Taq酶，1 μl；cyp51AF/R各1 μl；ddH2O，36 μl。反應條件：95 ℃，3 min；95 ℃，30 s；54 ℃，30 s；72 ℃，2 min，35 循環；72 ℃，10 min；10 ℃，程序終止。PCR擴增片段經凝膠電泳確認條帶，切膠回收純化片段送至上海生工生物工程有限公司進行測序。測序序列使用BioEdit軟件比對差異堿基，確認差異位點。

2 結果與分析

2.1 水稻惡苗病菌的分離

江蘇鎮江地區采集的98株水稻惡苗病菌經實驗室單孢分離和純化培養，以其菌絲生長形態等表型特征，初步判斷全部成功分離上述98株水稻惡苗病菌。

2.2 水稻惡苗病菌的ITS鑒定

分離得到的98株水稻惡苗病菌菌絲DNA經ITS序列擴增得到的片段大小約為550 bp，測序堿基序列在NCBI-Blast數據庫比對同源度高的序列，使用系統發育進化樹分析確認98株全部是水稻惡苗病菌，如表1所示，其中藤倉鐮刀菌[17](Gibberellafujikuroi)90株，層出鐮刀菌[18](Fusariumproliferatum)6株，輪枝鐮刀菌[19](Fusariumverticillioides)1株，新知鐮刀菌[20-21](Fusariumandiyazi)1株。根據系統發育進化樹分析可知，江蘇鎮江地區水稻惡苗病菌優勢種群為藤倉鐮刀菌，占比為91.8 %，還出現了近些年才被鑒定的新種新知鐮刀菌1株。

表1 98株水稻惡苗病菌種屬鑒定結果

2.3 水稻惡苗病菌對咪鮮胺的敏感性分析

通過EC50鑒定結果可知，江蘇鎮江地區水稻惡苗病菌對咪鮮胺抗性水平在0.011～0.175 μg·mL-1。依據抗性倍數劃分結果顯示全部是抗性菌株，抗性菌株中高抗菌株占77.6 %，中抗菌株占22.4 %，高抗菌株成為江蘇鎮江惡苗病菌中的優勢種群(表2)。

2.4 水稻惡苗病菌抗性位點cyp51A的PCR檢測

cyp51A擴增產物大約為1500 bp，測序后使用BioEdit軟件分析比對之后，比對結果如圖1所示。對咪鮮胺產生顯著抗性菌株1、2與無抗性產生的敏感菌株3、4在咪鮮胺作用靶標位點cyp51A序列完全一致，說明水稻惡苗病菌對咪鮮胺產生明顯抗性不是由于靶標位點產生的點突變導致，可能是由于其他相關位點的點突變或轉錄過量表達等非核酸突變類型。

3 討 論

近年來，水稻惡苗病逐漸成為水稻生產的主要真菌病害之一，世界上水稻主產區包括我國的江蘇和安徽等地發生呈現加重趨勢，造成稻米產量10 %～20 %的損失。隨著稻田旱育秧技術的推廣，改善了苗床的透氣性，為水稻惡苗病菌繁殖提供有力的條件，加重該病害的發生。此外，該病害可以還可以依附于水稻種表進行傳代，藥劑浸種處理不徹底將再次加重病害的傳播。目前防治該病害除了依靠品種抗性之外，以多菌靈和咪鮮胺為主的化學農藥成為最主要的手段[23]。水稻惡苗病菌對多菌靈的抗性十分嚴重，藥效十分差勁。近年來，抗咪鮮胺的水稻惡苗病菌逐漸被發現，咪鮮胺防效同樣呈現下降趨勢。因此，調查水稻產區水稻惡苗病菌對咪酰胺的抗性水平，分析抗性產生的原因，為抗性改良和研發新型防治水稻惡苗病菌藥劑提供理論支持，保證稻米產量及安全。

表2江蘇鎮江地區水稻惡苗病菌對咪鮮胺抗性調查統計

Table 2 Survey and statistics on the resistance to prochloraz inFusariummoniliforein Zhenjiang, Jiangsu

抗性等級菌株總數抗性菌株數抗性占比(%)高抗987677.6中抗982222.4低抗9800

本研究從江蘇鎮江地區分離得到98株水稻惡苗病菌，ITS序列[24-25]系統發育進化樹確認全部屬于水稻惡苗病菌，主要優勢種群為有性態的藤倉鐮刀菌，還存在少量的層出鐮刀菌與新發現的新種新知鐮刀菌等，說明江蘇鎮江地區水稻惡苗病菌種群資源較為豐富，優勢致病種群明顯，與鄭睿等[22]報道一致。本研究測定上述98株水稻惡苗病菌對咪鮮胺的抗性水平，EC50結果顯示江蘇鎮江地區水稻惡苗病菌抗性比例為100 %，抗性菌株中高抗菌株占比77.6 %，說明水稻惡苗病菌對咪鮮胺已產生大規?？剐?，且抗性嚴重，咪鮮胺及其復配藥劑藥效才呈現逐年下降趨勢。鄭睿等[22]報道江蘇常州地區水稻惡苗病菌對咪鮮胺EC50平均值達到0.253 μg·mL-1，顯著高于江蘇鎮江地區的抗性水平，說明江蘇鎮江地區咪鮮胺抗性相比其他地區較低，但長期單一使用咪鮮胺及其復配藥劑防治水稻惡苗病，定向篩選水稻惡苗病菌抗藥性，依舊會導致抗藥性急劇加重，我們需要研究抗性產生的原因，延緩抗性產生，或為開發新型藥劑提供依據。

咪鮮胺類藥劑抑制水稻惡苗病菌等真菌主要途徑是抑制麥角甾醇生物合成路徑中必不可少的羊毛甾醇14-α去甲基酶(P45014DM，由cyp51A負責合成)[26-28]，該酶主要功能是催化羊毛甾醇的14-α位甲基的剪切，是常用的選擇性抗真菌藥物設計的靶標位點。趙志華和張錫明等[6,29-30]研究結果顯示水稻惡苗病菌對咪鮮胺產生抗性機制與麥角甾醇的合成機制有關，其次是菌體對藥劑的排泄作用導致藥劑流失而產生抗藥性，排泄機制可能與cyp51A的過量表達有關，與cyp51A基因的核酸序列無關。本研究分析了對咪鮮胺最敏感和抗性最嚴重的各2株水稻惡苗病菌株的cyp51A位點突變情況，結果顯示上述4株菌株的cyp51A位點均無明顯的點突變或其他類型突變，證明cyp51A位點不是導致水稻惡苗病菌對咪鮮胺產生抗性的原因。

圖1 2株抗性最高菌株與2株最敏感菌株cyp51A位點序列比對分析Fig.1 Alignment analysis of two highest resistant strains and two most sensitive strains of cyp51A

4 結 論

江蘇鎮江地區水稻惡苗病菌以藤倉鐮刀菌為優勢種群，對咪鮮胺已產生較高抗藥性，水稻惡苗病菌抗咪鮮胺機制非cyp51A點突變導致，可能與麥角甾醇合成途徑有關，也可能是菌體內cyp51A的mRNA過表達和直接排泄藥劑來達到對咪鮮胺產生抗性的目的。