鉛、鎘脅迫對果蠅生長發育和抗氧化能力的影響

李長春，王 永，姚國新，戴余軍，李國元

(1. 湖北工程學院生命科學技術學院，湖北 孝感 432000；2. 特色果蔬質量安全控制湖北省重點實驗室，湖北 孝感 432000)

1 材料與方法

1.1 實驗材料

擬果蠅(Drosophilasimulans)由湖北大學行為生態與進化生物學研究中心提供。Pb(NO3)2·3H2O、CdCl2·2.5H2O購自天津市風船科技有限公司，均為分析純。蛋白質定量測定試劑盒(考馬斯亮藍法)、總抗氧化能力(T-AOC)測定試劑盒、超氧化物歧化酶測定試劑盒、過氧化氫酶測定試劑盒購自蘇州科銘生物技術有限公司。恒溫光照培養箱(MJX-2508-Z)由上海博迅實業有限公司生產，全自動多功能酶標儀(Enspire)購自美國PerkinElmer公司。

1.2 果蠅的飼養

果蠅培養于5 cm×12 cm平底玻璃試管中。置于(23±1)°C，相對濕度60 %～80 %，光周期14 h:10 h (L/D)的恒溫光照培養箱中。培養基配方為：玉米粉62.5 g，紅糖50.0 g，酵母粉7.5 g，瓊脂粉5.0 g，苯甲酸鈉0.1 g，丙酸2 mL，雙蒸水500 mL。

1.3 果蠅的染毒處理

通過向培養基添加Pb2+、Cd2+水溶液使果蠅染毒。設置鉛、鎘單一污染濃度各2個：10 mg/L Pb2+(Pb10)、20 mg/L Pb2+(Pb20)和10 mg/L Cd2+(Cd10)、20 mg/L Cd2+(Cd20)；鉛鎘復合污染濃度2個：10 mg/L Pb2++ 10 mg/L Cd2+(PC10)，20 mg/L Pb2++ 20 mg/L Cd2+(PC20)；未添加鉛鎘的培養基作對照(CK)。每個處理設置6個重復。乙醚麻醉后，收集從無污染培養基上8 h內孵化出的果蠅成蟲接種于培養基含鎘的培養瓶和對照瓶中，每瓶接種雌雄果蠅各10只，5 d后清除果蠅成蟲。每處理6次重復。

1.4 生長發育指標的測定

每天早上8:00定時檢查，記錄每管果蠅開始化蛹和開始羽化時間；分別在各管出現第1個蛹和成蟲后的第5天記錄各管成蛹的個數和羽化的果蠅數；接種后第10天后每組隨機選取10頭幼蟲稱重，羽化當天隨機選擇各組雌雄成蟲各10只稱重。性別比 = 雌果蠅數/果蠅總數。

1.5 酶活性的測定

隨機收集成熟后第2天的雌雄果蠅，麻醉后稱取0.1 g，加入質量(g) ：體積(mL) 9倍的預冷的生理鹽水，置冰水混合物上研磨勻漿。4 ℃下，3000 r/min，離心10 min，取上清液。加入4倍體積生理鹽水得濃度為2 %的組織勻漿，作為待測液。樣本蛋白質含量、總抗氧化能力(T-AOC)、SOD和CAT活性用蘇州科銘生物技術有限公司試劑盒測定。每毫克蛋白每分鐘使反應體系的吸光度增加0.01定義為一個總抗氧化能力單位；反應體系中SOD抑制率達50 %時所對應的酶量定義為一個SOD活力單位；每毫克蛋白每分鐘內催化降解1 nmol H2O2定義為一個CAT活力單位。

1.6 統計分析

數據用Mean±SE表示。不同處理間的差異采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)。不同處理間平均數的差異顯著性采用最小顯著差數法(1east significant difference, LSD)進行比較。所有數據均用SPSS 21.0進行處理。

2 結果與分析

2.1 Pb2+、Cd2+單一及復合脅迫對果蠅生長發育的影響

Pb2+、Cd2+單一及復合處理顯著延長了果蠅的化蛹時間和羽化時間，不同處理間，化蛹時間(F=20.937，df=6，P<0.001)和羽化時間(F=43.259，df=6，P<0.001)差異顯著。相同濃度下，Cd2+單一處理時幼蟲化蛹時間和羽化時間大于Pb2+單一處理，Pb2+、Cd2+復合處理時幼蟲化蛹時間和羽化時間大于Pb2+、Cd2+單一處理。10 mg/L Cd2+與20 mg/L Pb2+單一處理組之間(P=0.156)，10 mg/L Cd2+單一處理與10 mg/L Pb2++10 mg/L Cd2+復合處理組之間(P=0.334)，以及20 mg/L Cd2+單一處理與20 mg/L Pb2++20 mg/L Cd2+復合處理組之間果蠅化蛹時間的差異不顯著(P=0.625)。10 mg/L Pb2+與20 mg/L Pb2+單一處理組之間(P=0.082)，10 mg/L Cd2+、20 mg/L Cd2+單一處理和10 mg/L+10 mg/L 鉛鎘復合處理組之間果蠅羽化時間的差異不顯著(P=0.096，表1)。

表1 Pb2+、Cd2+單一及復合脅迫對果蠅生長發育的影響

注：平均數的多重比較采用LSD法。標注不同字母表示不同處理間差異性顯著(P<0.05)。

Note: LSD method was used for multiple comparisons of means. Different letters above columns indicate significant difference among treatments (P<0.05).

Pb2+、Cd2+單一及復合處理明顯降低了果蠅體重，幼蟲體重(F=65.343，df=6，P<0.001)、雌果蠅體重(F=19.626，df=6，P<0.001)和雄果蠅體重(F=26.095，df=6，P<0.001)受重金屬脅迫差異顯著。Pb2+、Cd2+單一脅迫時，果蠅體重隨濃度的增大顯著降低，相同濃度Cd2+脅迫時果蠅成蟲體重顯著低于Pb2+脅迫時體重，20 mg/L Pb2+單一處理、10 mg/L Cd2+單一處理、10 mg/L +10 mg/L鉛鎘復合處理之間雌雄果蠅體重差異不顯著，20 mg/L Pb2+、Cd2+復合處理和20 mg/L Cd2+單一處理間差異不顯著(P<0.05，表1)。

2.2 Pb2+、Cd2+單一及復合脅迫對果蠅對果蠅性別比的影響

Pb2+、Cd2+單一和復合脅迫對果蠅的性別比產生了顯著影響(F=15.734，df=6，P<0.001，圖1)。10 mg/L Pb2+、Cd2+單一和復合脅迫對果蠅的性別比沒有顯著影響(P=0.164)。20 mg/L Pb2+、Cd2+單一和復合脅迫下果蠅的性別比顯著高于對照(P<0.01)，且20 mg/L Pb2++ 20 mg/L Cd2+復合脅迫和20 mg/L Cd2+脅迫時果蠅性別比顯著高于20 mg/L Pb2+脅迫時果蠅的性別比(P<0.01)。

平均數的多重比較采用LSD法。標注不同字母表示不同處理間差異性顯著(P<0.05)LSD method was used for multiple comparisons of means. Different letters above columns indicate significant difference among treatments (P<0.05)圖1 Pb2+、Cd2+單一及復合脅迫對果蠅性別比的影響Fig.1 Effects of single and combined pollution of Pb2+ and Cd2+ on sex ratio of Drosophila simulans

2.3 Pb2+、Cd2+單一及復合脅迫對果蠅抗氧化能力的影響

Pb2+、Cd2+單一和復合脅迫顯著抑制了雌雄果蠅T-AOC、SOD和CAT的活性(圖2)，不同處理間果蠅T-AOC活性(雌：F=95.836，df=6，P<0.001；雄：F=210.101，df=6，P<0.001)、SOD活性(雌：F=82.557，df=6，P<0.001；雄：F=244.559，df=6，P<0.001)和CAT活性(雌：F=39.219，df=6，P<0.001；雄：F=6，df=6，P<0.001)差異顯著。雌雄果蠅10和20 mg/L Pb2+單一處理間T-AOC活性差異不顯著，10 mg/L Pb2+、Cd2+復合處理T-AOC活性顯著低于10 mg/L Pb2+單一處理，高于10 mg/L Cd2+單一處理，隨著濃度升高，20 mg/L Pb2+、Cd2+復合處理T-AOC活性明顯低于對應的單一處理(P<0.05)。Pb2+、Cd2+單一及復合處理下，果蠅體內SOD和CAT活性變化趨勢相同，單一處理條件下，果蠅體內SOD和CAT活性分別隨Pb2+和Cd2+濃度的增大而顯著降低，10和20 mg/L Pb2+、Cd2+復合處理時，SOD和CAT活性顯著低于對應的單一處理(P<0.05)。

3 討 論

果蠅是毒理學研究中有重要潛在價值的模式生物[12]，然而目前研究較多的是黑腹果蠅Drosophilamelanogaster，關于擬果蠅的報道很少。有研究指出重金屬脅迫可顯著抑制果蠅D.melanogaster的生長、繁殖[13]。本研究中，Pb2+、Cd2+單一和復合脅迫下，果蠅的化蛹時間和羽化時間顯著延長，蛹重和成蟲體重顯著下降，且表現出明顯的濃度依賴性，此結果表明，擬果蠅可以對Pb2+、Cd2+污染提供較好的指示作用。重金屬可以與細胞內的分子直接作用，影響其正常的活性和生理功能，還可以通過引起細胞內ROS的過量產生，對細胞產生間接損傷[10]。生物體可以對重金屬脅迫進行有效的抵御，但是以降低其生長發育為代價的[14]。相同濃度的Cd2+對果蠅生長發育和抗氧化能力的影響顯著高于Pb2+，表明Cd2+比Pb2+對果蠅有更大的毒性。在Pb2+、Cd2+濃度相同的情況下，復合脅迫比單一脅迫對果蠅的生長發育和抗氧化能力的抑制作用更強，說明二者具有協同作用，加大了對果蠅的毒害[15-16]，進一步證實復合污染下兩種或多種有毒物質對生物體的毒害效應與單一物質有所不同[4,17]。

A.總抗氧化能力；B. 超氧化物歧化酶；C.過氧化氫酶。平均數的多重比較采用LSD法。標注不同大寫字母表示雌果蠅不同處理間差異性顯著，不同小寫字母表示雄果蠅不同處理間差異性顯著(P<0.05)A. T-AOC；B. SOD；C. CAT. LSD method was used for multiple comparisons of means, Different uppercase letters and lowercase letters denote a significant difference among females and males, respectively (P<0.05)圖2 Pb2+、Cd2+單一及復合脅迫對果蠅抗氧化能力的影響Fig.2 Effects of single and combined pollution of Pb2+ and Cd2+ on antioxidant capacity of Drosophila simulans

重金屬脅迫下，不同生物在不同的情況下會采取不同的抗氧化策略。蟲體內SOD、CAT等抗氧化酶活性增強或抑制的現象都有報道，酶活性變化特點與物種類型、發育階段、性別，以及重金屬的種類、濃度、形態和作用時間等因素有關[18]。如，舞毒蛾Lymantriadispar在不同發育階段采取不同抗氧化策略抵御Cd2+造成的脅迫，飼料中添加50 μg Cd/g干重時，舞毒蛾各齡期幼蟲SOD活性相比對照組沒有顯著變化，CAT活性在3齡期顯著下降，在6齡期顯著升高[19]。中華稻蝗Oxyachinensis幼蟲在Cr6+脅迫下SOD活性隨處理濃度變化不明顯，CAT、GPx活性隨Cr6+濃度增加呈先增加后降低的趨勢[20]。低濃度的鎘可以刺激文哈Meretrixmeretrix體內SOD和CAT活性的提高，但高濃度的鎘則抑制它們的活性[21]。本研究中，果蠅體內的總抗氧化能力T-AOC，以及SOD和CAT 的活性均表現為抑制現象，且與脅迫的重金屬濃度相關，可能與果蠅持續受到高濃度重金屬脅迫有關，這與陳壁鋒等[22]研究結果，黑腹果蠅體內SOD活性隨Pb2+濃度升高而降低相似。說明昆蟲抗氧化系統抵御氧化脅迫的能力是有限的，低劑量的重金屬可以誘導蟲體抗氧化基因的表達，高劑量重金屬的持續脅迫則會造成抗氧化系統的破壞[23]。

4 結 論

Cd2+比Pb2+單一或復合脅迫顯著抑制果蠅的生長發育和抗氧化能力。相同濃度Cd2+比Pb2+對果蠅的毒害作用更大，相同濃度的Pb2+、Cd2+復合脅迫對果蠅的毒害作用高于單一脅迫。