超高效液相色譜-串聯質譜法測定4種漿果中5-硝基鄰甲氧基苯酚鈉和對硝基苯酚鈉殘留量

許 旭，侯 雪， 韓 梅，邱世婷，毛建霏

(1.中國科學院成都有機化學研究所，四川 成都 610041；2. 四川省農業科學院分析測試中心，四川 成都 610066；3.農業部農產品質量安全風險評估實驗室(成都)，四川 成都 610066；4.中國科學院大學，北京 100049)

【研究意義】植物生長調節劑(PGRs)是一類具有天然植物激素生理活性的人工合成的小分子化合物，能夠有效促進、抑制或改變植物生長發育[1-3]。5-硝基鄰甲氧基苯酚鈉(Sodium 5-nitroguaiacolate, 5NG)和對硝基苯酚鈉(Sodium para-nitrophenolate, SD2)作為復硝酚鈉的主要成分，是一種高效的PGRs，可通過提高細胞活力、促進細胞原生質流動從而加速細胞生長，提高產量并增強抗逆能力[4-5]。此外，5NG和SD2還作為魚、蝦等生長藥物添加劑，廣泛應用于水產養殖業中[6]。雖然5NG和SD2毒性較低，但長期食用含有5NG和SD2的食品，會對人類的身體產生潛在的危害[7]。【前人研究進展】目前，國內外對5NG和SD2的研究不夠深入，其殘留安全期和毒理機制尚不明確，5NG和SD2在食物和環境中的毒性及殘留成為近幾年來人們越來越關心的問題。雖然，許多國家和組織對可食用植物中常用PGRs的最大殘留限量(MRLs)值有各自的規定[8-11]，但對5NG和SD2尚未有明確規定。關于硝基酚類化合物的檢測方法主要有分光光度法、電位法、氣相色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜-質譜法和液相色譜-串聯質譜法等[12-16]。HPLC基質干擾嚴重，靈敏度低，不能提供分析物的結構信息，容易出現假陽性；GC-MS測定時往往需要衍生化，操作繁瑣；而LC-MS/MS以保留時間、離子對及離子比率作為定性標準，靈敏度高、準確性好。目前，國內外已有很多采用LC-MS/MS測定食品中其他PGRs殘留量的報道[17-19]，但對5NG和SD2的研究較少，不能滿足檢測樣品種類的要求。【本研究切入點】本文通過優化色譜條件及質譜參數，建立了UPLC-MS/MS檢測4種水果中5NG和SD2的分析方法。【擬解決的關鍵問題】以期為漿果中5NG和SD2殘留量的快速檢測提供便捷的手段。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

島津LC-30 AD UPLC液相色譜儀(日本Shimadzu公司)和AB SCIEX QTRAP 4500串聯質譜儀(美國AB公司)，植物生長調節劑標準物質：對硝基苯酚鈉和5-硝基鄰甲氧基苯酚鈉購自Dr. Ehrenstorfer公司，純度均>97 %。乙腈、甲醇、甲酸、乙酸氨均為色譜純(美國Fisher Scientific公司)。

1.2 標準溶液的配制

1.2.1 標準儲備液配制 分別準確稱取對硝基苯酚鈉和5-硝基鄰甲氧基苯酚鈉標準品，用甲醇配制濃度為100 mg/L的標準儲備液，-18 ℃儲存，再移取儲備液各1 mL，定容至50 mL，配置成2 mg/L的混合標準工作液。

1.2.2 基質匹配混合標準工作液配制 取不含待測物的藍莓、樹莓、草莓及車厘子樣品，按1.3節的前處理方法制得空白基質溶液，并用其稀釋混合標準工作溶液，配成0.02、0.04、0.20、0.40、0.80、1.60和2.00 mg/kg的基質匹配混合標準工作溶液，現配現用。

1.3 樣品前處理

提取：準確稱取10.0 g(精確至0.1 g)樣品于50 mL具塞離心管中，加入20 mL乙腈，渦旋1 min混勻。

分配：加入4.0 g無水硫酸鎂、1.0 g氯化鈉，迅速振搖，渦旋2 min，5000 r/min離心5.0 min，取上清液1∶1(v/v)加水稀釋后，過0.22 μm濾膜，上機檢測。

1.4 超高效液相色譜條件

色譜柱：CAPCELL PKA-C18 色譜柱(100 mm×2.1 mm，2 μm)；流動相：A為含5 mmol/L乙酸銨和0.1 %甲酸的水溶液，B為甲醇；流速：0.3 mL/min；進樣量：5 μl；柱溫：35 ℃。梯度洗脫程序為：0～2 min，10 %B-50 %B；2～6 min，50 %B-90 %B；6～6.1 min，90 %B-10 %B。

1.5 質譜條件

采用電噴霧離子源(ESI)負離子模式、多反應監測(MRM)掃描。電噴霧電壓(IS)：-4500 V；離子源溫度：550 ℃;霧化氣(GS1)：60 psi；輔助氣(GS2)：60 psi；氣簾氣(CUR)：40 psi; 定性離子對、定量離子對、去簇電壓(Declusteringpotential: DP)和碰撞能(Collision energy:CE)見表1。

表1 2種植物生長調節劑的保留時間及質譜參數

圖1 MRM下對硝基苯酚鈉和5-硝基鄰甲氧基苯酚鈉的提取離子流色譜圖Fig.1 The extracted ion chromatograms of 5NG and SD2 under the MRM

1.6 基質效應

通過相對響應值法(基質效應=空白基質標準響應值/純溶劑標準響應值)，考察分析物的基質效應。當比值大于1時為基質增強效應，反之，為基質抑制效應[20-21]。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優化

使用直接進樣分析目標化合物的標準溶液，優化5NG和SD2 2種植物生長調節劑的質譜條件。在負離子掃描模式下，發現2種化合物均可產生穩定的[M-H]-，選擇[M-H]-作為2種植物調節劑的母離子，逐級優化離子對的碰撞能量和去簇電壓，從而得到響應相對更高的MRM相應，優化后的參數設置見表1。基于已經優化的質譜條件，建立LC-MS/MS分析方法。2種植物生長調節劑5NG和SD2的提取離子流色譜圖如圖1所示。

2.2 基質效應

基質效應是指基質中的某些共提取物組分對待測物的測定準確度的影響。LC-MS/MS中基質成分雖可以不被監測，但會隨目標物共流出，從而影響化合物的離子化效率，從而抑制或增強化合物信號[22-23]。這可能是因為非揮發性的共流出成分在毛細管出口尖端時，與分析物競爭電離，阻礙或增強了分析物的離子化效果[24-25]。為了提高待測化合物的測定準確度，應對不同基質產生的基質效應進行評價，從而選擇合適方法減小基質效應的影響。本文采用相對響應值法對對硝基苯酚鈉和5-硝基鄰甲氧基苯酚鈉在不同基質提取液中的基質效應進行評價(表2)。4種水果基質均對對硝基苯酚鈉和5-硝基鄰甲氧基苯酚鈉有不同程度的基質效應，其中藍莓、樹莓和車厘子主要表現為基質增強效應，而草莓表現為基質抑制效應。因此，基質效應不可忽略，應采用空白基質匹配標準溶液，進行定量分析。

2.3 方法的線性范圍和檢出限

取1.2.2節的基質匹配混合標準工作溶液，在儀器工作條件下進行分析，采用外標法定量，根據5NG和SD2的定量MRM峰面積(Y)對質量濃度(X)繪制基質匹配標準曲線。以3倍信噪比計算方法檢出限，10倍信噪比計算方法定量限。如表3所示：在0.02～2.00 mg/kg范圍內，5NG和SD2線性關系良好，相關系數(r)均大于0.9968，方法的檢出限在0.28～0.73 μg/kg，定量限在0.93～2.43 μg/kg。

表2 對硝基苯酚鈉和5-硝基鄰甲氧基苯酚鈉在不同基質提取液中的基質效應

表3不同基質中2種植物調節劑的線性方程、相關系數、檢出限和定量限

Table 3 Linear equations, correlation coefficients (r), limits of detection (LODs) and limits of quantitation (LOQs) for two plant growth regulators in different matrices

化合物Compounds基質Matrix線性方程Regression equationrLOD(μg/kg)LOQ(μg/kg)5NG藍莓Y=8.98×106X-4.16×1040.99970.732.43樹莓Y=8.94×106X-1.99×1040.99990.632.10草莓Y=7.86×106X-2.85×1040.99980.541.80車厘子Y=1.59×106X-6855.70.99910.712.37SD2藍莓Y=5.13×106X+7.31×1040.99910.431.43樹莓Y=5.43×106X+9.07×1040.99690.401.33草莓Y=4.93×106X+6.87×1040.99680.321.07車厘子Y=5.53×106X+1.17×1050.99850.280.93

表4 2種植物調節劑在不同基質中的添加回收率及相對標準偏差(n=6)

2.4 方法的精密度和準確度

取空白基質樣品，添加適量相當于0.02、0.04、0.40和2.00 mg/kg的混合標準工作溶液，按1.3節的條件平行測定6次。如表4所示：添加回收率在91.75 %～112.67 %，相對標準偏差(RSD)在1.07 %～5.76 %，符合方法學要求。

3 討 論

本文通過優化色譜條件，建立了超高效液相色譜-串聯質譜法 (UPLC-MS/MS)同時測定藍莓、樹莓、草莓和車厘子中5-硝基對甲氧基苯酚鈉和對硝基苯酚鈉殘留量的分析方法。樣品用乙腈提取，鹽析除水后直接離心，取上清液進行檢測，無需富集濃縮等特殊凈化步驟。而后對基質效應進行評價，4種水果基質均對對硝基苯酚鈉和5-硝基鄰甲氧基苯酚鈉有不同程度的基質效應，其中藍莓、樹莓和車厘子主要表現為基質增強效應，而草莓表現為基質抑制效應。在0.02～2.00 mg/kg范圍內，5NG和SD2的質量濃度與對應的峰面積間線性關系良好，相關系數均大于0.9968。5-硝基對甲氧基苯酚鈉和對硝基苯酚鈉在漿果類水果(藍莓、樹莓、草莓及車厘子)中的檢出限(LOD)別為0.28～0.73 μg/kg，定量限(LOQ)為0.93～2.43 μg/kg。在4個添加水平下，樣品添加回收試驗的平均回收率為91.75 %～112.67 %，相對標準偏差為1.07 %～5.76 %(n=6)。

4 結 論

實驗建立了藍莓、樹莓、草莓和車厘子中5-硝基對甲氧基苯酚鈉和對硝基苯酚鈉殘留量的快速分析方法。該方法前處理過程簡單、方法靈敏度高、線性關系、回收率和精密度均能滿足農藥殘留分析的要求。可作為漿果中5-硝基對甲氧基苯酚鈉和對硝基苯酚鈉的快速確證和測定方法。