杜仲內生真菌發酵產物多糖的體外細胞毒活性篩選

岑娟 張峰

摘 ?要：目的 ?該文對從杜仲內生真菌發酵產生的多糖成分進行體外細胞毒活性篩選。方法 ?采用MTT法，用杜仲內生真菌多糖對7種腫瘤細胞進行體外細胞毒實驗。結果 ?實驗結果發現，杜仲內生真菌發酵產物中的多糖成分對HL-7702和Hela腫瘤細胞的IC50值分別為17.493.91和9.5216.24。結論 ?實驗結果表明杜仲內生真菌發酵產物杜仲多糖對部分腫瘤細胞具有一定的細胞毒作用。

關鍵詞：杜仲 ?內生真菌 ?抑菌作用

中圖分類號：S567 ? 文獻標識碼：A 文章編號：1672-3791（2019）12（c）-0156-02

植物內生菌代謝產物豐富多樣，活性作用也不盡相同，具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤、殺蟲和免疫抑制等生物活性，有一些內生菌還能產生活性物質，與宿主植物藥用成分相同。所以，在活性物質篩選和新藥研發方面，內生菌具有無窮潛力[1]。2003年，李雅等人[2]最早開始了對杜仲內生菌的研究，他們采用WA-抗生素培養基和PDA培養基，從采自陜西楊凌的杜仲各個組織中分離到了49株內生真菌。然后，用蘋果腐爛病菌（Cyt-osporasp）作為致病菌株，對分離到的這49株內生真菌進行了抗菌活性測定，結果發現，有22株菌株對至少3種致病菌有顯著的抑制作用。Chen等人[3]研究發現，對從四川成都杜仲葉和樹皮中分離得到的29株內生真菌進行抗菌活性篩選后，發現大部分內生真菌都可以抑制供試病原細菌，但是抑制供試病原真菌的效果不太顯著。丁婷等人[4]研究發現，從杜仲中分離出32株內生真菌中，屬于梭孢殼屬的內生真菌DGS08對玉米紋枯病菌的生長有很好的抑制作用。該文對篩選出得杜仲內生真菌代謝產物多糖進行抗腫瘤活性篩選。

1 ?材料

1.1 試劑

青鏈霉素混合液（Solarbio），DMEM高糖培養基（Gibco），優級胎牛血清（tbd science），二甲基亞砜（DMSO）（天津市富宇精細化工有限公司），四甲基噻唑藍（MTT）（Sigma）;胰蛋白酶（Trypsin）美國Amresco公司。

1.2 細胞株

MCF-7（人乳腺癌細胞株），K562（人慢性髓系白血病），HeLa（人宮頸癌），A549（肺腺癌細胞株），SMMC-7721（人肝癌細胞），HepG-2（人肝癌細胞系），MDA-MB-231（人高轉移性惡性乳腺癌細胞）：南京凱基生物技術股份有限公司。

HL-7702（正常人肝細胞）：中國科學院上海細胞庫。

1.3 儀器

500-831型全長酶標儀（Thermo Fisher Scientific），2424-2型CO2培養箱（上海科瑞生物技術有限公司），TDL-50B型低速臺式離心機（舜宇儀器有限公司），JJ-CJ-2FD超凈化工作臺（吳江市凈化設備總廠產品）。

2 ?實驗方法

2.1 細胞的培養

將MCF-7、SMMC-7721、MDA-MB-231、K562、HL-7702、HeLa、HepG-2、A549在37℃，5%CO2條件下用含10%胎牛血清、青霉素1×105U/L及鏈霉素100mg/L的DMEM培養基培養至細胞對數期。

2.2 MTT法檢測細胞活性

取對數生長期的各個細胞株按4×105/孔接種到96孔板中，37℃，5%CO2條件下培養24h后設置正常組（不加化合物），實驗組（100mg/mL、50L、5、1、0.5mg/mL）分別加到96孔板中，每個濃度設置6個平行復孔，繼續孵育48h后，在避光條件下每孔給予10μLMTT（5mg/mL），繼續放置于37℃、5%CO2培養箱中培養，4h后，棄去上清液，每孔加入100μL的DMSO（分析純）溶液，放置于室溫條件下，100rpm的震蕩箱下震蕩10min直至MTT反應的藍色結晶產物完全溶解，置于多功能酶標儀中，設置570nm的波長下檢測吸光度（Optical Density，OD），讀出OD值帶入公式中，求得細胞抑制率，并計算IC50值。實驗重復3次。

細胞抑制率%=（1-實驗組OD值/正常組OD值）×100%

3 ?實驗結果

由表1可知：杜仲多糖對MCF-7、SMMC-7721、MDA-MB-231、K562、HL-7702、HepG-2細胞作用48h后，對細胞沒有明顯的抑制率（P>0.05），從表中可以看出杜仲多糖對HeLa，A549細胞有明顯的抑制率（P<0.05），IC50值分別為17.49±3.91和9.521±6.24。

由圖1可知，不同濃度的杜仲多糖對A549細胞的生長均有一定的抑制作用。當杜仲多糖對A549細胞作用48h，濃度在0.5～5mg/mL抑制率波動不明顯，但有顯著性差異（P<0.01），隨著多糖濃度的增加，濃度在50mg/mL時對細胞的抑制率明顯增強（P<0.01），而且50mg/mL的時候抑制率為80%，達到一個平臺期，濃度在100mg/mL時抑制率為78%。

4 ?討論

在觀察杜仲多糖對細胞增殖的抑制作用時，我們首先采用MTT法來進行實驗，以篩選杜仲多糖有效作用濃度范圍及IC50，然后采用MTT法測定各實驗組細胞的生長抑制率。杜仲多糖各組作用HeLa，A549細胞后，其生長均受到了顯著的抑制。隨著濃度的升高，抑制率也不斷升高，說明藥物的作用具有濃度依賴性。

近年來多糖類的抗腫瘤作用引起了人們廣泛的注意，除可通過增強宿主免疫功能而發揮抗腫瘤作用外，多糖還能通過誘導腫瘤細胞凋亡等途徑直接殺傷腫瘤細胞，從辛曉明的報道中可以看出杜仲總多糖具有顯著的腫瘤抑制作用，并能夠提高胸腺指數、脾指數、外周血白細胞計數和骨髓有核細胞計數，增強宿主免疫功能而發揮抗腫瘤作用。

參考文獻

[1] 曾松榮，徐成東，王海坤，等.藥用植物內生真菌及其具宿主相同活性成分的機制初探[J].中草藥，2000，31（4）：306-308.

[2] 李雅，宋曉斌，馬養民，等.杜仲內生真菌對植物病原真菌的抑菌活性研究[J].西北農林科技大學學報：自然科學版，2007，35（2）：69-73.

[3] Chen XM， Sang YX， Li SH， et al. Studies on a chlorogenic acid-producing endophytic fungi isolated from Eucommia ulmoides Oliver [J].J Ind Microbiol Biotechnol，2010，37（5）：447.

[4] 丁婷，孫微微，韓亞惠，等.杜仲內生真菌DZJ07在小麥根際定殖及對根部酶活的影響[J].核農學報，2015，29（6）：1149-1157.