2個小麥株高QTL位點驗證及其對產量相關性狀的效應分析

李 濤, 陸 炳, 李 俊，鄧光兵，張海莉，梁俊俊，余懋群*，楊武云，龍 海

(1. 中國科學院成都生物研究所，四川 成都 610041；2. 中國科學院大學，北京 100049；3. 四川省農業科學院，四川 成都 610066)

【研究意義】小麥(TriticumaestivumL.)作為最重要的糧食作物之一，養活了全球35 %的人口，為人類提供了重要的能量攝入和蛋白質來源[1-2]。然而隨著人口增長和可用耕地的減少，糧食危機正在變得越來越嚴重。因此實現小麥的高產、穩產對于解決全球糧食危機極其重要[3]?！厩叭搜芯窟M展】自20世紀60年代各國在小麥育種中通過引進小麥矮桿(Reduced height，Rht)基因降低小麥株高(Plant height，PH)，增加抗倒伏能力使得小麥產量呈直線上升后[4]，株高性狀受到了國內外育種家的高度關注并做了大量的研究，旨在發現更多控制小麥株高的關鍵基因。迄今在小麥21條染色體上，已經有超過50個控制株高的數量性狀位點(Quantitative trait locus，QTL)被報道[5-10]。其中Gao等基于高密度遺傳圖譜在周842B×中國春的重組自交系群體中鑒定到了5個株高QTL，分別位于染色體2A、4A、4B、4D和5A[11]。Zhang等在染色體1D、2B、3A、3D、4A、4B、5A和6B鑒定到了8個株高相關QTL[9]。Cui等利用3個中國小麥品種構建的2個重組自交系，在小麥21條染色體上都鑒定到了與株高相關的QTL[12]。此外還有24個能夠降低株高7 % (Rht8)～55 % (Rht5)的關鍵基因被命名為Rht基因，分布于小麥染色體2AS、2BL、2DS、3BS、4BS、4DS、5AL、5DL、6A和7A[13-15]。株高的降低雖然能提高抗倒伏能力和種植密度，卻與主要產量性狀存在矛盾,既隨著株高的大幅度下降,后代往往出現晚熟、早衰、粒癟等特征，并最終導致產量下降。孫耀中等利用771份株高具有顯著差異的材料探究株高與產量性狀的關系發現，小麥植株的矮化會導致千粒重和穗粒重的顯著降低[16]。Rht5基因被報道在降低株高的同時會嚴重影響籽粒數(-66 %)[13]；Rht2矮化株系導致千粒重降低0.7～5.6 g[17]。此外，RhtB1、RhtD1和Rht12都被報道在降低株高時會對籽粒重產生不同程度的負效應[18]。【本研究切入點】因此,在小麥育種工作中，對于株高的調控必須兼顧其與產量性狀的關系，注意綜合因素的影響，使株高與產量性狀有機結合，以達到高產穩產的目的[16]。陸炳等利用川麥42×川農16重組自交系，基于高密度遺傳連鎖圖譜鑒定到了2個未曾報道的顯著株高QTL[19]。其中來自于川麥42的Qph.cib-5A具有17.25 %的表型貢獻率，來自川農16的Qph.cibb-7A具有13.18 %的表型貢獻率[20]?！緮M解決的關鍵問題】為了能夠驗證這兩個株高顯著位點的真實性并解析其與千粒重、穗粒數等產量性狀的關系，從而為在小麥育種中的利用提供理論依據，本研究利用從川麥42×川農16重組自交系中衍生出的2個F2群體通過開發KASP標記的方法鑒定Qph.cib-5A和Qph.cibb-7A的真實性，并通過3個四川小麥品種川麥42、川麥39和川農16構建的2個重組自交系群體闡明這2個位點在不同遺傳背景中對株高及重要產量性狀的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究利用的實驗材料包括2個重組自交系群體和2個F2群體：含127個家系的川麥42×川農16構建重組自交系[19]由四川省農科院楊武云研究員提供；含193個家系的川麥42×川麥39重組自交系(F9:F10)由中科院成都生物研究所農業生物技術中心分子育種實驗室構建；川麥42×川農16重組自交系中篩選的株系(RIL-21和RIL-36)通過與2個親本雜交得到的2個F2衍生群體，其中F2-1為RIL-21與川農16雜交得到的153個F2單株，F2-2為RIL-36與川麥42雜交得到的187個F2單株。

1.2 田間試驗設計和性狀評價

川麥42×川農16重組自交系群體和川麥42×川麥39重組自交系群體分別于2015-2016、2016-2017年種植于四川雙流和什邡(共3個環境)；F2-1和F2-2群體于2017種植于雙流。田間試驗采用完全隨機區組設計，每個區組包括3行，每行1.5 m寬，2.5 m長，45粒種子均勻的種植于每一行。收獲前進行田間性狀調查，每行隨機選取5株，調查株高(Plant height, PH)、穗長(Spike length, SL)、千粒重(Thousand kernel weight, TKW)、穗粒數(Grain number spike-1, GNS) 4個性狀。其中株高和穗長利用尺子人工測量，千粒重和穗粒數通過萬深SC-G拷種儀器得到。

1.3 表型數據分析

利用Microsoft Office excel 2013進行表型數據處理，包括顯著性檢驗，頻率分布直方圖繪制，均值的計算等。利用R軟件進行最佳線性無偏預測值(The best linear unbiased predictions, BLUP)的計算[21]。

1.4 DNA的提取

田間采集小麥幼嫩葉片組織，通過CTAB法提取基因組DNA[22]，Thermo ND 2000微量分光光度計檢測DNA的濃度和純度。提取的DNA樣本放置于-20 ℃保存備用。

1.5 KASP引物及KASP反應

根據陸炳等鑒定到的與Qph.cib-5A和Qph.cibb-7A緊密連鎖的單核苷酸多態性標記(Single nucleotide polymorphism, SNP)開發KASP標記，通過KASP反應鑒定F2群體基因型。KASP反應體系由混合引物，Master Mix和樣本DNA組成。其中混合引物由2條末端堿基不同的正向引物和1條共同的反向引物組成，其組分包括40 μl的dd H2O，15 μl的正向引物(100 μmol·L-1)和30 μl的反向引物(100 μmol·L-1)；Master Mix來自于LGC(https://www.lgcgroup.com/)；DNA通過CTAB法提取。PCR體系為10 μl，包括5 μl的DNA樣本(10 ng·μl-1)、5 μl Master Mix和0.14 μl的混合引物。PCR程序為94 ℃預變性15 min；94 ℃變性20 s, 61 ℃退火和延伸1 min，10個循環，每個循環延伸溫度降低0.6 ℃；94 ℃變性20 s，55 ℃退火和延伸1 min，26個循環；37 ℃熒光讀取1 min。KASP反應所需組分加于96孔板，在CFX ConnectTMReal-Time System 中選取“FAM”和“HEX”2種熒光進行PCR反應并在反應結束后讀取終端熒光信號。

1.6 基因分型

F2-1和F2-2群體利用KASP反應進行基因分型；川麥42×川農16重組自交系群體利用小麥90K SNP芯片進行基因分型(陸炳等2017)；川麥42×川麥39重組自交系群體利用小麥35k育種家芯片進行基因分型，由北京中玉金標記生物技術有限公司完成。

2 結果與分析

2.1 表型分析

Qph.cib-5A和Qph.cibb-7A位點具有正向效應的等位基因分別來自川麥42和川農16。因此，我們從川麥42×川農16重組自交系中篩選出同時具有這2種基因型的家系RIL21和RIL36，并利用其分別與川農16和川麥42雜交，構建了2個衍生F2群體：F2-1和F2-2。F2-1群體中，Qph.cibb-7A位點與川麥42基因型一致，Qph.cib-5A存在分離；F2-2群體中，Qph.cib-5A位點與川農16一致，Qph.cibb-7A存在分離。親本和群體種植在同樣的環境，以同樣的方式進行性狀數據測定。表型數據分析顯示在F2群體中，親本之間株高差異大，群體中分布范圍廣，符合正態分布，具有典型的數量遺傳特征。在兩個重組自交系群體中，株高、穗長、穗粒數、千粒重也呈正態分布(表1，圖1)。根據相關性分析結果(表2)，株高、穗長和千粒重在2個重組自交系群體中彼此呈正相關，因此株高的增加對千粒重和穗長的增加具有正效應。此外在川麥42×川麥39重組自交系群體中穗粒數與株高和千粒重呈負相關，與穗長不具有相關性。在川麥42×川農16重組自交系群體中穗粒數與株高和穗長呈正相關，與千粒重不具有相關性。

表1 表型性狀在群體和親本中的分布

表22個重組自交系中株高、穗長、穗粒數和千粒重基于BLUP值的相關性

Table 2 Correlation coefficient of plant height (PH), spike length (SL), thousand kernel weight (TKW) and grain number spike-1(GNS) based on the BLUP value in two recombinant inbred line populations

川麥42×川農16RIL川麥42×川麥39RIL株高 PH穗長 SL穗粒數 GNS千粒重TKW株高 PH穗長 SL穗粒數 GNS千粒重TKW株高 PH0.41???0.15??0.47???株高 PH0.57???-0.22??0.27???穗長 SL0.41???0.49???0.3???穗長 SL0.57???-0.07ns0.26???穗粒數 GNS0.15??0.49???0.035ns穗粒數 GNS-0.22??-0.07ns-0.24???千粒重TKW0.47???0.3???0.035ns千粒重TKW0.27???0.26???-0.24???

注：*，**和***分別表示在P=0.05、P=0.01和P=0.001水平上顯著相關。

Note：*, ** and *** indicate significance at the 0.05，0.01 and 0.001 levels, respectively.

圖1 株高在4個群體中的頻率分布Fig.1 Frequency distribution of plant height (PH) in four populations

2.2 利用F2群體驗證Qph.cib-5A和Qph.cibb-7A的真實性

2.2.1 KASP標記開發及F2群體篩選 將陸炳等鑒定到的與Qph.cib-5A和Qph.cibb-7A緊密連鎖的SNP標記，開發成了多個可直接用于PCR檢測的KASP標記。通過檢測川麥42和川農16之間的差異，最終在5A和7A上各得到1條在兩親本之間具有顯著差異的KASP標記，分別命名為“PH-5A”和“PHb-7A”。其中PH-5A位于染色體5A長臂461.49 Mb，PHb-7A位于染色體7A長臂562.10 Mb。由于PH-5A和PHb-7A是根據與Qph.cib-5A和Qph.cibb-7A緊密連鎖的SNP設計而來，因此這2個KASP標記也與Qph.cib-5A和Qph.cibb-7A存在緊密連鎖關系，可在其他群體中對Qph.cib-5A和Qph.cibb-7A進行追蹤定位和分型(表3，圖2)。

表3 Qph.cib-5A和Qph.cibb-7A位點開發的KASP標記引物

KASP檢測結果顯示，153個F2-1個體中在Qph.cib-5A位點純合AA基因型(即具有正向增加株高的等位基因型)的株系有33株，純合aa基因型的株系有51株，雜合Aa基因型的株系有69株；187份F2-2株系中，在Qph.cib-7Aa位點，純合BB基因型的株系50株，純合bb基因型的株系46株，雜合Bb基因型的株系91株(圖2)。

2.2.2Qph.cib-5A和Qph.cibb-7A在F2群體中對株高的效應 根據基因型將F2-1和F2-2群體分成3組，比較3組不同基因型單株高度差異。在F2-1群體中，Qph.cib-5A位點純合AA基因型株系的株高為100.36 cm；純合aa基因型株系的株高為92.58 cm；雜合Aa基因型株系株高為93.8 cm。其中純合AA基因型株系株高顯著高于純合aa基因型株系株高7.78 cm(7.75 %)和雜合Aa基因型株系株高6.56 cm(6.54 %)；雜合Aa基因型和與純合aa基因型株系之間株高沒有顯著性差異(圖3)。

“A”和“B”代表增加株高的基因型；“a”和“b”代表降低株高基因型；t檢驗(P<0.05)檢測差異顯著性；“1”表示AA與Aa或BB與Bb之間差異顯著性；“2”代表Aa與aa或Bb與bb之間的差異顯著性；“3”代表AA與aa或BB與bb之間差異顯著性；*，**和***分別表示在P = 0.05、P = 0.01和P=0.001水平上顯著相關‘A’ and ‘B’ represent the genotype of increasing plant height; ‘a’ and ‘b’ represent the genotype of reducing plant height; Student’s t test (P<0.05) was used to identify differences; ‘1’ represents the difference of AA/Aa or BB/Bb; ‘2’ represents the difference of Aa/aa or Bb/bb; ‘3’ represents the difference of AA/aa or BB/bb; *, ** and *** indicate significance at the 0.05，0.01 and 0.001 level, respectively圖3 Qph.cib-5A和Qph.cibb-7A在F2群體中對株高的遺傳效應Fig.3 The effect of Qph.cib-5A and Qph.cibb-7A for plant height in F2 population

Table 4 The effect ofQph.cib-5AandQph.cibb-7Ain the Chuannong 16×Chuanmai42 and Chuanmai 39 × Chuanmai42 recombinant inbred lines

群體Populationtraits性狀Qph.cib-5AAAaa差異(%)DifferenceQph.cibb-7ABBbb差異(%)DifferenceQph.cib-5A/Qph.cibb-7AAABBaabb差異(%)DifferenceCM42×CN16株高(PH)92.1±6.482.9±5.510???90.2±7.484.7±6.76.1???93.7±5.781.4±5.513.1???穗長(SL)9.9±0.79±0.59.1???9.6±0.79.5±0.7110±0.69.2±0.58???穗粒數(GNS)46.8±4.547±3.9-0.446.8±4.147.7±4.3-1.946.2±4.346.8±3.7-1.3千粒重(TKW)50.9±3.248.6±3.44.5??50.5±3.348.5±3.54??52±348.1±3.97.5??CM42×CM39株高(PH)98.7±7.794.6±74.2???98.4±8.795.2±6.13.3?102.3±8.794.7±67.4???穗長(SL)12.5±1.612±1.24?12.3±1.612.4±1.3-0.812.5±1.812.1±1.23.2穗粒數(GNS)46.4±3.347±5-1.347.5±4.246.7±4.71.746.8±3.847.4±5.6-1.3千粒重(TKW)51±3.849.7±4.42.5?51.3±4.250±3.52.5?51.5±3.549.1±3.94.7??

注：“A”和“B”代表增加株高的基因型；“a”和“b”代表降低株高基因型；值表示為均值±標準偏差；差異性=(高值-低值)/高值× 100 %，t檢驗(P<0.05)檢測差異顯著性； *，**和***分別表示在P=0.05、P=0.01和P=0.001水平上顯著相關。

Note:‘A’and ‘B’ represent the genotype of increasing plant height; ‘a’ and ‘b’ represent the genotype of reducing plant height; Values are the mean ± SD (standard deviation);Student’s t test (P< 0.05) was used to identify differences, Difference (%)=(Mean tall-Mean dwarf)/Mean tall × 100 %; *, ** and *** indicate significance at the 0.05,0.01 and 0.001 level, respectively.

F2-2群體中，在Qph.cibb-7A位點純合BB基因型株系株高為99.47 cm，純合bb基因型株系株高為93.31 cm，雜合Bb基因型株系株高為96.52 cm。顯著性差異分析顯示，純合BB基因型株系的株高顯著高于純合bb基因型株系株高6.16 cm(6.19 %)和雜合Bb基因型株系的株高2.95 cm(2.97 %)。純合bb基因型株系和雜合Bb基因型株系之間株高同樣具有顯著性差異且Bb基因型株系株高高于bb基因型株系3.21 cm(3.33 %,圖3)。

2.3 Qph.cib-5A和Qph.cibb-7A在不同遺傳背景中的效應及與主要產量性狀的關系

分析川麥39、川麥42和川農16在Qph.cib-5A和Qph.cibb-7A位點的基因型顯示，在這2個株高位點川麥39與川農16具有相同的基因型。因此用川麥42和川麥39構建的重組自交系群體在這2個位點中存在分離?；诖藶榱诉M一步鑒定Qph.cib-5A和Qph.cibb-7A在不同遺傳背景中的效應，根據Qph.cib-5A(461.49 Mb)和Qph.cibb-7A(562.10 Mb)在染色體上的位置，結合90K SNP芯片和35K SNP芯片對川麥42×川農16重組自交系和川麥42×川麥39重組自交系的基因分型結果，將2個群體分為6組。通過比較6個組別之間株高、穗長、穗粒數和千粒重的差異，解析Qph.cib-5A和Qph.cibb-7A在不同遺傳背景中對株高和產量性狀的影響。

由表4可知，在川麥42×川農16重組自交系群體中Qph.cib-5A能顯著的增加株高10 %，穗長9.1 %和千粒重4.5 %，對小麥的穗粒數沒有影響。在川麥42×川麥39重組自交系中Qph.cib-5A顯著增加株高4.2 %，穗長4 %和千粒重2.5 %。Qph.cibb-7A對株高和千粒重的顯著影響在2個群體中也同時存在。在川麥42×川農16重組自交系群體中，Qph.cibb-7A株高和千粒重的增加效應分別為6.1 %和4 %；在川麥42×川麥39重組自交系中，Qph.cibb-7A對株高和千粒重的增加3.3 %和2.5 %，而對穗長和穗粒數基本沒影響。此外，當同時聚合了Qph.cib-5A和Qph.cibb-7A時，在川麥42×川農16重組自交系群體中株高增加13.1 %，穗長增加8 %，千粒重增加7.5 %，對穗粒數基本無影響；而在在川麥42×川麥39重組自交系中，株高增加7.4 %，千粒重增加4.7 %，穗長和穗粒數基本不受影響。

3 討 論

3.1 Qph.cib-5A和Qph.cibb-7A與已報道QTL位點比較

國內外育種家在不同的遺傳群體，不同的種植環境，不同的遺傳背景下定位到了許多株高相關QTL。Yu等利用W7984×Opata85構建了重組自交系，基于高密度遺傳圖譜在染色體5A的104.22 Mb處鑒定到一個株高相關QTL[23]。Gao等利用90K芯片，在周8425B×中國春重組自交系中鑒定到2個株高相關QTL，分別位于染色體5A短臂和7A短臂[11]。葉亞瓊等利用2個冬小麥品種隴鑒19與Q9086雜交創建的重組自交系群體在染色體5A染色體Xbarc141～Xcfd2121區間和7A染色體Xpsp3001～Xgwm63區間各檢測到一個多環境穩定表達的株高QTL位點[24]，BLAST結果顯示，Xbarc141位于5A長臂468.94 Mb，Xpsp3001位于7A染色體94.43 Mb，Xgwm63位于7A染色體133.13 Mb。此外在已經報道的Rht基因中，Rht12和Rht22分別位于染色體5A和7A，其中Rht12位于在染色體5A長臂678.29 Mb[25]。Rht22位于染色體7A短臂[26]。本實驗室陸炳等利用2個四川麥品種川農16和川麥42創制的RIL群體[20]，基于90K芯片鑒定到的兩個主效株高QTL，Qph.cib-5A和Qph.cib-7A，分別與本研究開發的位于染色體5A長臂461.49 Mb和染色體7A長臂562.10 Mb處的KASP標記緊密連鎖。與先前報道的株高相關QTL和Rht基因比較發現，Qph.cib-5A與葉亞瓊等報道的一個株高QTL和Rht12都位于染色體長臂，因此需要進一步驗證是否為同一個株高位點；Qph.cibb-7A與先前報道的QTL和Rht基因都不同，可能是一個新的主效株高QTL。

3.2 Qph.cib-5A和Qph.cibb-7A與Rht基因對株高效應的比較

目前，已命名的株高相關Rht基因有24個，分布于小麥染色體2AS、2BL、2DS、3BS、4BS、4DS、5AL、5DL、6A和7A上[27-31]。其中只有Rht-B1b、Rht-B1c、Rht-D1b和Rht-D1c被克隆。在前人對Rht基因的研究中，許琦等在210份冬小麥品系中發現Rht-B1b、Rht-D1b和Rht8對小麥平均株高的降稈作用分別為9.7、16.7和2.5 cm[32]。赤霉素敏感基因Rht4、Rht8、Rht12和Rht13可以通過縮短小麥不同節間長度分別降低株高17 %、7 %、40 %和34 %[14]。Rebetzke等報道Rht5能夠顯著的降低株高55 %[13]；Wurschum等報道Rht24能夠降低小麥株高8 cm[15]。在本研究中，Qph.cib-5A和Qph.cibb-7A在不同群體對株高都具有顯著效應。F2群體中單個Qph.cib-5A和Qph.cibb-7A分別增加株高7.78和6.16 cm，對株高的遺傳效應與Rht8相似。相同的效應在其他2個重組自交系群體中也能被觀察到，只是在川麥42×川麥39重組自交系群體中對株高的影響相對較弱，這可能是由于在該群體中還有其他主效基因控制株高，使得Qph.cib-5A和Qph.cibb-7A的遺傳效應不能充分體現導致的。此外在Qph.cib-5A位點，雜合基因型株系的株高顯著低于純合AA基因型株系的株高，而與純合aa基因型株系株高沒有差異，說明在Qph.cib-5A位點降低株高的aa基因型具有較強的顯性效應。

3.3 Qph.cib-5A和Qph.cibb-7A在不同遺傳背景中的效應及其與主要產量性狀的關系

過矮的植株，標志著營養器官的消弱,不利于產量的增加[16]。而過高的植株又會導致植株抗倒伏能力減弱，種植密度降低，最終也會使小麥減產。因此在育種過程中對于株高的調控，一定要協調其與主要產量性狀之間的關系，只有這樣才能達到最大收獲指數的育種目標?；诖耍狙芯客ㄟ^比較Qph.cib-5A和Qph.cibb-7A在2個重組自交系群體中對株高、千粒重、穗粒數和穗長的影響，解析其在調控株高的同時與主要產量性狀之間的關系。研究發現，Qph.cib-5A和Qph.cibb-7A在增加株高4.1～9.2和3.2～5.5 cm的同時能顯著增加千粒重1.3～2.3和1.3～2 g，而對穗粒數無明顯影響。此外，當聚合了Qph.cib-5A和Qph.cibb-7A時，植株的株高和千粒重分別增加7.6～12.3 cm和2.4～3.9 g，表現出效應的疊加。雖然Qph.cib-5A和Qph.cibb-7A對株高的影響不及多數Rht基因，但這種疊加效應能夠在較大范圍(3.2～12.3 cm)內對株高進行調控。下一步將繼續開發與Qph.cib-5A和Qph.cibb-7A連鎖更加緊密的標記，以便于其在育種中更好的利用。

4 結 論

Qph.cib-5A和Qph.cibb-7A在不同的遺傳背景中對小麥株高都具有顯著的調控作用，此外在調控株高的同時會影響千粒重和穗長，而不會作用于穗粒數。同時聚合2個位點時對株高、穗長、千粒重的效應值大于只有單個QTL或沒有QTL位點時的效應。該研究可為株高遺傳機制的解析和控制株高基因的精細定位提供理論依據，也能為小麥育種提供可用的分子標記和理論基礎。