馬來西亞鏈霉菌ECO 00002產Azalomycin F發酵條件優化

張 慶，白亭亭，李銘剛，何 翔，徐勝濤，倪 明 ，番華彩，曾 莉，楊佩文*

(1.云南省農業科學院農業環境資源研究所，云南 昆明 650205；2.云南大學，云南 昆明 650091；3.云南農業大學植物保護學院，云南 昆明 650201)

【研究意義】 楊佩文等針對馬來西亞鏈霉菌S.malaysiensisECO 00002活性化合物分離及結構分析顯示，該菌株活性部位主要含兩種結構類似的同系化合物，經HPLC制備純化，并通過詳細的1H和13C NMR數據測定及文獻對比分析，確定活性化合物為阿扎霉素F3和F4[1]。前期生物活性測定結果表明，其對多種植物病原真菌有較強的抑菌活性[2]。然而前期研究表明，該活性化合物產量較低，難以滿足工業化生產的需要，限制了對它的進一步研究和開發利用。【前人研究進展】阿扎霉素 F類化合物最早于1959年由Arai從吸水鏈霉菌阿扎霉素變種(S.hygroscopicusvar.azalomyceticus) 中分離得到，主要成分為3 個36 元多羥基大環內酯化合物阿扎霉素 F5a、F4a和 F3a[3-5]，目前報道的該類化合物約30個[6-7]。阿扎霉素 F類化合物具有高效廣譜抗植物病原真菌活性，小鼠(mouse)口服LD50為300～580 mg/kg，大鼠(rat)口服LD50為980 mg/kg，其毒性分級為低毒III級，具備開發為防治作物真菌病害的低毒高效農用抗生素的潛力[8]。【本研究的切入點】根據該菌株生長特性和活性化合物阿扎霉素F合成的條件需求，優化發酵培養基和發酵條件，創造適合菌株生長和目標活性化合物合成的最佳條件，充分發揮菌種的生產潛力，是提高菌株發酵水平和降低生產成本的有效途徑[9-10]。【擬解決的關鍵問題】本研究以提高馬來西亞鏈霉菌ECO 00002的阿扎霉素F產量為目標，在對菌株種子培養條件優化的基礎上，重點考察碳氮源對目標活性化合物生物合成的影響，篩選適宜的碳氮源，優化其配比，并進一步優化菌株發酵條件，為菌株發酵工藝產業化提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 菌株

云南大學微生物研究所保藏菌種馬來西亞鏈霉菌S.malaysiensisECO-00002。

1.2 培養基

基礎培養基：酵母膏4 g，葡萄糖4 g，麥芽膏5 g，復合維生素(維生素B11 mg，維生素B61 mg，核黃素1 mg，煙酸1 mg，苯丙氨酸1 mg，生物素1 mg，丙氨酸0.3 mg)，微量鹽(FeSO4·7H2O20 mg，MnCl2·2H2O 10 mg，ZnSO4·7H2O10 mg)，瓊脂20 g，水1000 mL，pH 7.5，制作平板和試管斜面。液體種子培養基：葡萄糖14.5 g，酵母膏15 g，麥芽膏20 g，CaCO33 g，MgSO4·7H2O 1 g，MnSO4·4H2O 0.1 g，KH2PO40.2 g，水1000 mL，pH 7.5。PB試驗和RSM試驗培養基：采用STATISTICA 6.0進行試驗設計，并配制相應培養基，培養基于1×105Pa下滅菌20 min。

1.3 PB和RSA試驗方法

采用PB設計考察主要的碳氮源成分對阿扎霉素F產量的影響，篩選適宜的碳氮源；在此基礎上，采用RSA法優化適宜碳氮源的比例。具體方法：將供試菌株接種于斜面試管培養基上，然后置于28 ℃恒溫條件下培養120 h。再用滅菌蒸餾水洗下菌體，并按照10 % 的接種量接入裝有100 mL 種子培養基的500 mL 三角瓶中，28 ℃下200 r/min 振蕩培養至48 h。再取種子液10 mL接種于裝有100 mL發酵液(PB培養基和RSA培養基)的500 mL三角瓶中，于28 ℃下200 r/min振蕩培養72 h，測定阿扎霉素F的含量。

1.4 發酵條件優化試驗方法

在培養基優化的基礎上，采用單因素試驗進行溫度、起始pH、發酵瓶裝液量、接種量、發酵時間等發酵條件對阿扎霉素F產量的影響試驗。溫度設置24 ℃，28 ℃，32 ℃，36 ℃等4個梯度；pH值設置6.0，6.5，7.0，7.5，8.0等5梯度；裝液量設置50 mL/500 mL，75 mL/500 mL，100 mL/500 mL，125 mL/500 mL等4梯度；接種量設置2 %，4 %，6 %，8 %，10 %等5個梯度；發酵時間設置8，16，32，40，48，64，72，80，88，96，104 h等11個梯度。測定各試驗阿扎霉素F的含量。

1.5 發酵罐放大發酵試驗方法

利用50 L自動生物發酵罐驗證菌株擴大培養的發酵條件。將發酵罐內外全面清洗干凈，檢查發酵罐的密閉性。用標準pH緩沖液對罐體上的pH監測探頭進行校準。裝入配制好的優化培養基25 L，關閉發酵罐頂蓋。通過發酵罐控制面板設定滅菌程序滅菌30 min。待溫度冷卻后，通過火焰圈接種法按10 %接種量接種。設定發酵參數：攪拌轉速150 r/min，溫度28 ℃，通氣量60 L/min，進氣壓力1.0 bar、罐內壓0.3 bar。從24 h后開始定時取樣，取樣量為50 mL，測定菌體體積和阿扎霉素F的含量。

1.6 分析方法

菌體體積測定：將所取發酵液10 mL裝到帶刻度的試管中，靜置12 h后測量菌絲沉降體積。阿扎霉素F含量測定：取發酵液50 mL，進樣于經過預處理的大孔樹脂層析柱，然后分別用甲醇∶水體積比為6∶4、7∶3、10∶0的洗脫液梯度洗脫，HPLC測定10∶0洗脫部分阿扎霉素F含量。HPLC系統采用Waters 515二元高壓泵，2966PDA檢測器，Hanban C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)，柱溫30 ℃，流動相為甲醇∶水(8∶2)，檢測波長241.0 nm，進樣量20 μl，流速1.0 mL/min，分析時間20 min。含量根據色譜峰面積與標準品的峰面積對比進行計算。

2 結果與分析

2.1 PB試驗結果與分析

采用STATISTICA 6.0軟件進行PB試驗設計，對發酵培養組成中的葡萄糖、淀粉、酵母膏、大豆粉、NaCl、K2HPO4等6個因素進行篩選，每個因素設高低2個水平，實驗設計與結果如表1～2所示。

由回歸分析可知，大豆粉和葡萄糖是主要的影響因素，二者在大于95 %的概率水平上差異顯著。淀粉、酵母膏、NaCl、K2HPO4等4個因素在95 %的概率水平上差異不顯著，由此確定大豆粉和葡萄糖為主要因素進行下一步實驗。

2.2 RSA試驗結果與分析

在PB實驗回歸分析基礎上，采用STATISTICA 6.0軟件進行RSA試驗設計，對葡萄糖和大豆粉的配比進行優化，實驗設計及結果如表3～4和圖1所示。

試驗結果表明：各因素之間有一定交互作用，二次方模型與上述結果的擬合較好(模型的R2>0.98)。各因素優化的比例為葡萄糖1.59 %，大豆粉2.90 %。

表1 發酵培養基碳氮源篩選PB試驗設計與結果

表2 發酵培養基中的碳氮源篩選試驗統計分析結果

表3 碳氮源濃度響應面試驗設計及阿扎霉素產量測定結果

表4 碳氮源濃度響應面試驗統計分析結果

圖1 響應面分析法確定響應最大值Fig.1 The maximum response value determined by RSA test

2.3 發酵條件優化試驗結果與分析

菌株發酵條件優化結果表明(表5)：發酵溫度在24～36 ℃，隨著溫度提高阿扎霉素F HPLC效價先提高后下降，28 ℃時效價為最高。發酵培養基初始pH在6.0～8.0，隨著pH升高阿扎霉素F HPLC效價先提高后下降，7.5時效價為最高。在500 mL三角瓶裝液量為50 mL時阿扎霉素F HPLC效價最高，隨著裝液量的增加效價逐漸下降；接種量分別以2 %、4 %、6 %、8 %、10 %接種，隨著接種量的增加阿扎霉素F HPLC效價逐漸提高。綜合考慮裝液量、通氣量和生產成本，適宜裝液量為100 mL/500 mL，接種量為10 %。阿扎霉素F在0～16 h時間段沒有合成，而在24～72 h時間段內大量合成，并在72 h時HPLC效價達到最高值，之后逐漸下降，因此，確定菌株的發酵終點定為72 h。

表5 發酵條件優化結果

將一級種子接種到優化后的發酵培養基，于優化的培養條件下發酵培養。不同時間取樣，測定阿扎霉素F HPLC效價、菌絲生物量及pH，試驗結果表6所示。48 h前，菌體處于指數生長期，發酵液pH一直下降；48 h后，菌體生長進入穩定期，阿扎霉素F合成速度加快，在72 h HPLC效價達最高，為1950.26 μg/mL。隨著時間延長，阿扎霉素F HPLC效價呈下降趨勢，88 h發酵液pH值急劇上升，顯微鏡檢察發現菌體自溶。在優化的發酵條件下，阿扎霉素F HPLC效價由原來的637.59 μg/mL上升到1950.26 μg/mL，HPLC效價提高約205.88 %(P<0.01)。

2.4 發酵罐放大發酵試驗結果與分析

50 L自動生物發酵罐驗證優化條件試驗過程中，各階段阿扎霉素F含量和菌絲體沉降體積變化情況如表7所示。從上罐至18 h，菌體開始生長，整個過程中菌絲體積的變化呈現平緩增加的趨勢，阿扎霉素F從24 h時開始產生，到63 h時達到最高效價，為2094.12 μg /mL。

表7 發酵過程中阿扎霉素F和菌絲沉降體積結果

3 討 論

3.1 阿扎霉素 F類化合物農抗應用前景及存在問題

阿扎霉素F是一類含氧雜環的大環內酯類化合物，文獻報道從S.hygroscopicusvar.azalornyceticus、S.hygroscopicusA1491、S.violaceusnigerRS-22、S.hygroscopicusMSU/IVIIV-4-75B、Actinomycetesp. HILY-9120362、S.malaysiensisECO-00002、S.malaysiensisMJM1968J 及S. sp. 211726等多種鏈霉菌的發酵產物中先后發現了該類化合物，具有顯著的抗真菌、革蘭氏陽性菌和抗腫瘤活性，具備開發為高效農用抗生素的潛力，但由于缺乏系統成藥基礎研究，導致下游開發形成瓶頸，截止目前尚未作為農用抗生素在國內登記使用[11-17]。馬來西亞鏈霉菌ECO 00002分離自云南省寧蒗縣土壤樣品產阿扎霉素新的野生型菌株，產率相對較低，通過選育優良菌株或利用基因工程技術構建高產菌株，結合現代發酵工程和代謝工程技術，優化菌株定向發酵調控工藝，提高活性化合物阿扎霉素F的生產率，是實現產業化開發的主要途徑。本研究結果表明，通過發酵條件優化，可以顯著提高目標活性化合物阿扎霉素F的產率，而選育優良菌株或利用基因工程技術構建高產菌株是下一步需要重點開展的研究內容。

3.2 阿扎霉素 F類化合物代謝調控的闡明對于菌株選育、遺傳改良和發酵優化的指導作用

闡明阿扎霉素F類化合物的形成遺傳機制和生物合成過程是菌株選育和遺傳改良的基礎，也是菌株發酵條件優化的前提。阿扎霉素F類化合物的生物合成是在復雜的調控系統的調控作用下完成，調控因子通過不同的機制發揮其全局調控的作用[18]。因此，通過調節正調控因子可以提高化合物的產率，抑制負調控因子可以解除對化合物合成的抑制作用而實現提高產率的目的。阿扎霉素F系含氧雜環的大環內酯類化合物，其生物合成是由包括酰基輔酶A活化羧酸等一系列多次重復的醇醛縮合反應，催化形成具有一定長度的聚酮鏈骨架，然后該聚酮鏈骨架經過環化，或者與脫氧糖等結構單元連接而形成[5]。阿扎霉素B的生物合成機制是最先被闡明的阿扎霉素類化合物，該化合物具有一個非常稀有的C-2對稱結構，屬于16元環大環內酯類化合物，其碳骨架主要來源于6個丙酸鹽、8個乙酸鹽和2個丁酸鹽，利用頭尾縮合式的聚酮類化合物的合成方式合成，其中包括來源于葡萄糖的2-脫氧巖藻糖，來源于丙酸鹽的3個甲基基團，結構中糖苷配基中的氧原子來源于聚酮生物合成過程中的前體物質[19]。而阿扎霉素F系列化合物的研究主要集中在活性測試和結構鑒定等方面，生物合成機制尚未完全明確[20]，化合物代謝調控的闡明對于菌株選育、遺傳改良和發酵優化的將具有重要的指導作用。

3.3 發酵條件優化對于阿扎霉素 F類化合物生物合成的影響

無機鹽、微量元素、生長因子、前體和抑制劑等培養基組成也是菌體生長繁殖和目標活性化合物的生物合成的重要影響因素。從阿扎素F類化合物生物合成途徑及與其相關的代謝途徑出發，篩選促進化合物生物合成的影響因素是提高產率的另一重要途徑。

4 結 論

馬來西亞鏈霉菌ECO 00002發酵培養基中主要的影響因素為大豆粉和葡萄糖，其最大響應值分別為2.90 %和1.59 %；優化的發酵條件為初始pH 7.5，裝液量100 mL/500 mL，接種量為10 %，發酵溫度28 ℃，發酵時間72 h。在優化的發酵培養基和發酵條件下，搖瓶水平上阿扎霉素F HPLC效價由原來的637.59 μg/mL上升到1950.26 μg/mL，HPLC效價提高率為205.88 %(P<0.01)；100 L發酵罐阿扎霉素F的HPLC效價為2094.12 μg /mL，阿扎霉素F類化合物的HPLC效價大幅度提高。