非洲豬瘟病毒P30-54融合蛋白在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)及反應(yīng)原性研究

李 杰，張星星，郭 晶，張國武，王曉婷，李 妍，才學(xué)鵬，孟慶玲 ，喬 軍*

(1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003；2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，新疆 石河子 832000；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，甘肅 蘭州 730046)

【研究意義】非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)所引起豬的一種烈性傳染病[1]。該病毒可感染所有品種和年齡的家豬和野豬，病死率高達(dá)80 %～100 %[2]。該病在我國被列為一類動(dòng)物疫病。ASF最初主要在非洲流行，近年來逐漸擴(kuò)散到地中海以及東歐等國家或地區(qū)[3-4]，特別是2017年俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)發(fā)生ASF疫情，使得ASF疫病傳入亞洲等國家的風(fēng)險(xiǎn)不斷增大[5]。目前，我國雖未發(fā)生該病，但該病輸入性風(fēng)險(xiǎn)極大。【前人研究進(jìn)展】在臨床上，ASF主要以高熱和內(nèi)臟器官出血為主要特征，與豬瘟(CSF)非常相似，因此無法通過臨床癥狀和病理變化進(jìn)行鑒別診斷，只有依賴于實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行確診[2,4]。目前，ASF的實(shí)驗(yàn)室診斷包括動(dòng)物接種、病毒分離、病毒核酸DNA 檢測和特異性抗體檢測等方法[6-8]。然而，動(dòng)物接種、病毒分離和病毒核酸DNA 等檢測方法或需要在生物安全三級(jí)以上的實(shí)驗(yàn)室，或需要專業(yè)的儀器設(shè)備和技術(shù)人員，或操作繁瑣，難以滿足基層檢疫部門的需要[6-7,9]。目前，血清學(xué)檢測是診斷和監(jiān)測豬感染ASFV的重要方法之一[9-10]。然而，現(xiàn)有的血清學(xué)診斷用抗原多細(xì)胞培養(yǎng)的ASFV全病毒抗原，這種抗原雖然敏感性較高，但培養(yǎng)活病毒會(huì)存在生物安全方面的隱患[11-12]。近年來，隨著ASFV全基因組測序的完成，國外學(xué)者歷史基因工程技術(shù)表達(dá)了ASFV重要的結(jié)構(gòu)蛋白(如P30、P54、P72和P14.5等)，并利用表達(dá)的重組蛋白用于ASFV血清學(xué)診斷用抗原的研發(fā)[9-13]。研究發(fā)現(xiàn)，單一重組蛋白抗原雖具有較高的特異性，但敏感性不高。因此，研發(fā)特異性高和反應(yīng)原性強(qiáng)的ASFV抗原對(duì)于高特異性和敏感性血清學(xué)診斷方法的建立至關(guān)重要。【本研究切入點(diǎn)】在前期構(gòu)建ASFV P30-54融合基因基礎(chǔ)上，本研究將P30-54融合蛋白基因克隆入桿狀病毒轉(zhuǎn)座載體質(zhì)粒pFastBac1中，在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，分析了重組蛋白的反應(yīng)原性。【擬解決的關(guān)鍵問題】為特異性高和反應(yīng)原性強(qiáng)的ASFV診斷用抗原的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 載體、菌株、培養(yǎng)基及試劑

pT-P30-54重組質(zhì)粒(含有P30-54融合基因)由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移載體pFastBacl、DH10Bac宿主菌、昆蟲細(xì)胞Sf9購自Invitrogen公司。IPTG、X-gal、限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ、基因組DNA提取試劑盒購自TaKaRa生物公司；昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基、水解乳蛋白購自GIBCO公司。小鼠抗ASFV P30-54融合蛋白多克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備。HRP標(biāo)記的兔抗鼠酶標(biāo)二抗、FITC標(biāo)記的兔抗鼠IgG熒光抗體購自Sigma公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù) P30-P54融合基因序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增P30-P54融合基因上游引物FP：5′-GGAATTCATGGATTTTATTTTAAATATATCC-3′(下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點(diǎn))，下游引物RP：5′-CCTCGAGTTACAAGGAGTTTTCCAGGTCTTT-3′(下劃線部分為XhoⅠ酶切位點(diǎn))，由北京華大基因公司合成。

1.3 重組轉(zhuǎn)移載體pFast-P30-P54的構(gòu)建與鑒定

以pT-P30-54重組載體為模板，用引物FP和RP 擴(kuò)增P30-P54融合基因。PCR的反應(yīng)體系為：H2O 9 μl，PCR Mixture 8 μl，上下游引物各0.5 μl，DNA模板2 μl。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性40 s，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸80 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。將PCR產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠電泳，將目的片段用DNA回收試劑盒回。將pFastBac1用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，回收線性化的pFastBac1載體大片段，將P30-P54融合基因與載體片段用T4 DNA連接酶連接并轉(zhuǎn)化JM109。 挑取單菌落，提取質(zhì)粒利用PCR和酶切進(jìn)行鑒定，獲得重組質(zhì)粒pFast-P30-P54。

1.4 重組質(zhì)粒Bacmid-P30-54的篩選和鑒定

將pFastBac1-P30-54轉(zhuǎn)化含有Bacmid的大腸桿菌DH10Bac，取稀釋液100 μl涂布于含有IPTG/X-gal、卡那霉素(50 μg/mL)、慶大霉素(7 μg/mL)和四環(huán)素(10 μg/mL)的LB平板，37 ℃培養(yǎng)24 h。挑取重組的白色菌落37 ℃培養(yǎng)24 h，進(jìn)行表型鑒定，按照Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)操作步驟提取重組Bacmid-G基因組，用P30-54基因特異性引物進(jìn)行PCR鑒定。

1.5 重組病毒reAcMNPV-P30-54的制備及鑒定

用LipofectamineTM將重組Bacmid-P30-54轉(zhuǎn)染6孔培養(yǎng)板上Sf9昆蟲細(xì)胞。將細(xì)胞盲傳3代后收集病變細(xì)胞培養(yǎng)物，反復(fù)凍融3次后，離心取上清得到重組病毒reAcMNPV-P30-54。提取接毒細(xì)胞基因組DNA，以其為模板，以P30-54融合基因特異性引物進(jìn)行PCR，分析目的基因是否插入到重組病毒基因組中。

1.6 重組融合蛋白P30-54的間接免疫熒光(IFA)的檢測

將1×105個(gè)細(xì)胞在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)，用reAcMNPV-P30-54接種細(xì)胞，以AcMNPV接毒細(xì)胞和正常sf9細(xì)胞作對(duì)照。在接毒72 h以后，用80 %的丙酮固定細(xì)胞，0.1 % PBST洗滌3次后，用10 %犢牛血清封閉，250 μl/孔，37 ℃孵育 1 h。洗滌3次后，加入1∶100稀釋的小鼠鼠抗ASFV陽性血清和陰性血清(對(duì)照)，100 μl/孔。37 ℃作用1 h，洗滌后加入1∶50稀釋的FITC標(biāo)記的兔抗鼠熒光二抗，37 ℃孵育 1 h，洗滌3次后在熒光顯微鏡下觀察。

1.7 重組融合蛋白P30-54的SDS-PAGE和Western blot分析

將5×105個(gè)細(xì)胞傳至24孔板，以reAcMNPV-P30-54接種細(xì)胞為試驗(yàn)組，用AcMNPV接毒細(xì)胞和正常sf9細(xì)胞作對(duì)照。在感染后72 h收集病變細(xì)胞，用0.01 mol/L pH 7.2 PBS洗滌3次，-20 ℃和37 ℃反復(fù)凍融3次，凍融，用離心后的上清進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot檢測，分析重組融合蛋白P30-54的反應(yīng)原性。

M. DNA marker (DL-15000+2000); 1. pFast-P30-54 的 EcoRⅠ+XhoⅠ雙酶切; 2. pFast-P30-54 的 EcoRⅠ酶切圖1 重組載體pFast-P30-54的酶切鑒定Fig.1 Identification of pFast-P30-54 by enzyme digestion

2 結(jié)果與分析

2.1 重組載體pFast-P30-54的構(gòu)建及鑒定

重組載體pFast-P30-54 雙酶切可得到1140 bp的目的基因片段和4775 bp的載體大片段(圖1)。PCR擴(kuò)增得到了與預(yù)計(jì)大小相符的DNA條帶。結(jié)果表明，成功構(gòu)建了P30-54目的基因的重組轉(zhuǎn)座載體pFast-P30-54。

2.2 重組載體Bacmid-P30-54陽性克隆的篩選及鑒定

重組載體pFast-P30-54轉(zhuǎn)化DH10Bac宿主菌后，將轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌涂布于含有IPTG/X-gal的抗性平板上進(jìn)行了3輪表型鑒定，在平板上可出現(xiàn)白色菌落和藍(lán)色菌落(圖2，見封三)。挑取陽性克隆(白色菌落)，用P30-54特異性引物擴(kuò)增，可以獲得與預(yù)期大小一致的1140 bp的目的基因片段(圖3)。

2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與重組病毒的制備

將重組質(zhì)粒Bacmid-P30-54分別轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞72 h后，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變(CPE)，主要表現(xiàn)為變大、變圓、脫落等。收集病變細(xì)胞，反復(fù)凍融3次，離心取上清即得到重組病毒reAcMNPV-P30-54。提取重組病毒基因組，用P30-54特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果可得到與預(yù)期一致擴(kuò)增產(chǎn)物(圖4)，表明成功得到了重組病毒。

M. DNA marker (DL-2000);1～2:重組質(zhì)粒Bacmid-P30-54的PCR擴(kuò)增圖3 重組載體Bacmid-P30-54的PCR鑒定Fig.3 Identification of Bacmid-P30-54 by PCR amplification

M:DNA marker (DL15000+2000); 1～2:重組病毒reAcMNPV-P30-54的PCR鑒定圖4 重組病毒reAcMNPV-P30-54的PCR鑒定Fig.4 Identification of recombinant reAcMNPV-P30-54 by PCR

2.4 重組融合蛋白P30-54的間接免疫熒光(IFA)檢測

重組Bacmid-P30-54分別轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞Sf9后，用含有目的基因的重組病毒reAcMNPV-P30-54的sf9細(xì)胞進(jìn)行IFA實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染重組病毒reAcMNPV-P30-54的sf9細(xì)胞發(fā)出黃綠色的熒光，而非重組病毒AcMNPV感染細(xì)胞無熒光(圖5，見封三)。

2.5 重組融合蛋白P30-54的SDS-PAGE與反應(yīng)原性分析鑒定

SDS-PAGE檢測結(jié)果證實(shí)，ASFV P30-54融合基因在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行了表達(dá)，分子量為42.5 kDa，與預(yù)期大小相符；接種非重組病毒AcMNPV的sf9細(xì)胞中無目的蛋白條帶出現(xiàn)。Westernblot分析結(jié)果表明，重組融合蛋白P30-54能與小鼠抗ASFV P30-54多克隆抗體發(fā)生特異性免疫學(xué)反應(yīng)(圖6)。

M：標(biāo)準(zhǔn)蛋白marker；1：接種reAcMNPV-P30-54的sf9細(xì)胞；2：接種非重組病毒AcMNPV的sf9細(xì)胞；W：Western blot 分析圖6 重組融合蛋白P30-54的SDS-PAGE和Western blot分析結(jié)果Fig.6 Analysis of recombinant fusion P30-54 protein by SDS-PAGE and Western blot

3 討 論

ASFV屬于非洲豬瘟病毒科(Asfarviridae)非洲豬瘟病毒屬(Asfarvirus)的成員[3,15]，該病毒只有1 個(gè)血清型，但不同地域ASFV分離株基因組存在著明顯的遺傳多樣性[16]。根據(jù)P72 基因遺傳進(jìn)化分析，目前可將ASFV 至少分為23 個(gè)基因型[16,19]。ASFV基因組長度在170～190 kb 之間，可編碼150～200個(gè)病毒蛋白[3]。目前的研究發(fā)現(xiàn)，在ASFV結(jié)構(gòu)蛋白中，P72、P54、P22、P12、P17、P30、P14.5、P150、P37及P34 等蛋白具有較強(qiáng)的抗原性[3,15.20]。

昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)具有真核生物蛋白質(zhì)翻譯后修飾所必需的酶系統(tǒng)，能有效進(jìn)行蛋白質(zhì)的翻譯后加工(糖基化、磷酸化或脂酰化)，表達(dá)蛋白的空間結(jié)構(gòu)及抗原性與天然蛋白十分相似，是一種常用的真核基因表達(dá)系統(tǒng)。目前，該系統(tǒng)已成功表達(dá)了禽流感病毒(AIV)、傳染性雞支氣管炎病毒(IBV)、藍(lán)舌病病毒(BTV)、雞法氏囊病病毒(IBDV)等多種動(dòng)物病毒的抗原蛋白。Oviedo等(1997)利用昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了ASFV P30和P54蛋白，并且通過間接ELISA評(píng)價(jià)了兩種重組蛋白用于檢測ASFV抗體的效力[11]。結(jié)果表明，p54重組蛋白表現(xiàn)出更強(qiáng)的反應(yīng)原性，但p30蛋白具有更高的敏感性。研究結(jié)果提示，將2種蛋白組合是研發(fā)ASFV特異性強(qiáng)。敏感性高的血清學(xué)診斷抗原的重要手段。Barderas等(2001)利用昆蟲細(xì)胞和粉紋夜蛾(Trichoplusiani)幼蟲細(xì)胞表達(dá)了ASFV p54/30嵌合蛋白，將重組蛋白免疫豬后可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生對(duì)強(qiáng)毒具有中和活性的高水平抗體，提示該嵌合蛋白具有良好的免疫原性[17]。Giménez-Lirola 等(2016)通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了ASFV P30和P54和P72蛋白基因[12]，利用熒光微珠免疫試驗(yàn)評(píng)估了純化的 P30和P54和P72重組蛋白對(duì)人工感染ASFV血清的檢測能力，結(jié)果表明3種蛋白中P30重組蛋白表現(xiàn)出更高的敏感性和特異性；基于P30重組蛋白的間接ELISA可以檢測出人工感染8～12 d的豬血清中ASFV特異性抗體，同時(shí)還可用于ASFV感染豬口腔分泌液中抗體的檢測。研究結(jié)果證實(shí)，ASFV 重組蛋白P30具有作為ASFV診斷抗原研發(fā)的潛力。曹琛福等(2016)利用成功構(gòu)建了含ASFV p54基因的重組桿狀病毒，并在昆蟲細(xì)胞中高效表達(dá)，通過免疫印跡試驗(yàn)和間接ELISA試驗(yàn)證實(shí)其具有良好的反應(yīng)原性；同時(shí)，利用原核表達(dá)的ASFVP54蛋白建立了檢測ASFV抗體的競爭ELISA方法，通過對(duì)血清樣品的檢測證實(shí)其具有較好的特異性和敏感性[21]。

為了研發(fā)特異性強(qiáng)、敏感性高的ASFV血清學(xué)診斷用抗原，本研究采用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了ASFV P30-54融合蛋白基因。通過IFA和Western blot證實(shí)ASFV P30-54重組融合蛋白在昆蟲 sf9細(xì)胞的胞內(nèi)表達(dá)，且重組蛋白具有較強(qiáng)的反應(yīng)原性，為特異性高和敏感性強(qiáng)的ASFV診斷方法的建立提供了一個(gè)有潛力的候選診斷用抗原。