2型豬鏈球菌細胞分裂蛋白GpsB的原核表達及其鑒定

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細菌細胞生長和分裂過程是息息相關的。眾多蛋白質構成復雜的功能網，它們在時間和空間上相互作用，保證分裂過程有條不紊地進行，最終使一個母細胞形成兩個相同的子細胞[1-3]。GpsB蛋白在細胞分裂過程中發揮著至關重要的作用，它可通過調控肽聚糖合成酶PBP1的活性來影響細胞壁的合成，并可與分裂體的中心組分FtsZ蛋白以及肽聚糖合成蛋白PBPs發生相互作用[4]。GpsB蛋白不僅與細胞分裂過程有關，還參與磷酸化調節。在枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)中，GpsB可被絲蘇氨酸激酶磷酸化，說明GpsB 可能參與內部與外部細胞壁結構的轉換[5]。另外在單細胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)研究中發現，gpsB對細菌毒力具有重要作用，該基因的缺失導致細菌生長受阻以及對細胞自溶更加敏感[6]。

豬鏈球菌(Streptococcussuis,S.suis)是一種重要的新發人獸共患病原體，根據S.suis莢膜多糖抗原的不同，可將其分為33個血清型，不同血清型之間的毒力不同，其中2型S.suis(S.suis2)致病性最強[7-8]。人感染該菌后可導致腦膜炎、心內膜炎以及敗血癥，嚴重者則因感染性休克而死亡[9-11]。據報道，S.suis2導致的中毒性休克綜合征感染人的死亡率可達20%[12]。因此對S.suis2的致病機理研究顯得至關重要。GpsB調控細胞分裂過程，且與細菌毒力有關，但在S.suis2中未見有關gpsB的研究報道，因此gpsB在S.suis2中的作用具有很高的研究價值。本實驗利用原核表達載體表達純化獲得rGpsB并制備其多克隆抗體，為進一步研究GpsB在S.suis2中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1菌株S.suis2菌株05ZYH33、表達載體pET32a由本實驗室保存，大腸桿菌感受態E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)購于北京全式金公司。

1.2試劑 pEASY-T1 simple 克隆試劑盒和GelStain購于北京全式金公司；PCR產物回收和質粒提取試劑盒以及IPTG購于上海生工生物工程公司；限制性內切酶BamH I和XhoI、T4連接酶和DNA Marker 購于日本Takara ；DNA膠回收試劑盒購于美國Promega 公司；Ni離子親和層析柱購于南京金斯瑞公司；羊抗鼠IgG(HRP標記)購于北京bioss公司。

1.3目的基因gpsB生物信息學分析 使用Blast檢索出GpsB的同源蛋白序列，用ClustalX R軟件分析上述氨基酸序列。

1.4gpsB基因的擴增 根據gpsB基因設計上下游引物，上游引物417F：5′-CGGGATCCATGGCAAGTATTAAATTTACG-3′ 下游引物417R：5′-CCCTCGAGTCATTCTTGATCCTGAACG-3′ (下劃線標注的分別為BamH I和XhoI兩個酶切位點。)引物由金維智公司合成。PCR反應程序為：95 ℃ 5 min， 95 ℃ 30 s， 54 ℃ 30 s，72 ℃ 25 s， 共30個循環；72 ℃ 10 min。目的片段經瓊脂糖凝膠電泳分析并回收。

1.5表達載體的構建與鑒定 參照文獻[13]略作修改。將目的片段與pEASY-T1 Simple Cloning Vector 連接，并轉化至Trans-T1感受態細胞中，挑取單菌落送至蘇州金維智公司測序。重組質粒與pET32a 載體經雙酶切(所用酶為BamH I和XhoI)、割膠回收、T4 DNA連接酶連接并轉化至感受態細胞E.coliDH5α，挑取單菌落送至蘇州金維智公司測序。

1.6rGpsB的表達純化及鑒定 將重組表達載體轉化至感受態細胞E.coliBL21(DE3)。將陽性轉化子接種于LB培養基中過夜培養，以1∶50的比例接種震蕩培養至OD600=0.6時，加入IPTG使其終濃度為0.1 mmol/L，震蕩培養3～4 h。離心收菌后，超聲破碎，離心10 min分離上清和沉淀，取適量上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳，將上清和包涵體中的蛋白分別純化，具體純化方法參考文獻[13]。采用兩組不同的抗體對重組蛋白進行Western blot 鑒定：1)以His-Tag 單克隆抗體(1∶2 000)為一抗，以HRP標記羊抗鼠IgG 單克隆抗體(1∶5 000)為二抗；2)以GpsB鼠多克隆抗體(1∶2 000)為一抗，以HRP標記羊抗鼠IgG 單克隆抗體(1∶5 000)為二抗。

1.7GpsB鼠多抗血清制備及效價測定[11]取6周齡BALB/c小鼠進行免疫，首次免疫將重組蛋白(100 μg/只)與完全弗氏佐劑等體積乳化，皮下多點注射。再次免疫改用不完全弗氏佐劑，每隔2周免疫一次，共免疫3次。最后用未經乳化的重組蛋白加強免疫，3 d后眼球取血。

2 結 果

2.1GpsB生物信息學分析 Blast 結果顯示，GpsB蛋白在S.suis菌株中高度保守，S.suis2菌株中的GpsB蛋白與S.azizii，S.marmotae，S.minor，S.ovis等不同細菌的GpsB同源性較高，相似性在83%～65%之間。

圖1 GpsB同源蛋白多重序列比對分析Fig.1 Alignment of GpsB homologous proteins from several bacteria

2.2gpsB基因的擴增 設計引物并進行PCR，獲得的產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。結果顯示擴增得到的產物大小在250～500 bp之間(圖2)，與預期目的基因大小(333 bp)一致，說明成功擴增出目的基因。

M: DNA marker, 1: gpsB PCR 產物

2.3重組質粒 pET32agpsB雙酶切鑒定 PCR 產物經雙酶切、瓊脂糖凝膠電泳結果如圖3所示，雙酶切結果顯示有兩個條帶，有一條帶大小在250～500 bp之間，與預期目的基因大小(333 bp)一致。測序結果顯示該片段序列與Genbank中SSU05_417序列一致，說明成功構建出重組表達載體。

M: DNA marker, 1: BamH I/XhoI雙酶切 pET32agpsB

2.4rGpsB 的誘導及表達形式鑒定 重組表達載體轉化E.coliBL21(DE3)后經IPTG誘導后，所表達的蛋白大小在25～35 kD之間，與預期蛋白(30 kD)大小一致；菌體經超聲破碎后進行SDS-PAGE電泳，結果顯示4號泳道誘導E.coliBL21/pET32agpsB重組菌在30 kD處有一條較深的條帶，說明GpsB蛋白被成功誘導出來，5號泳道顯示誘導BL21/pET32agpsB上清在30 kD處也有一條較深的條帶， 而6號泳道在對應位置無條帶出現，說明目的蛋白存在于上清中。

M:蛋白分子質量標準,1:未誘導E.coli BL21/pET32a,2:誘導E.coli BL21/pET32a,3:未誘導E.coli BL21/pET32agpsB重組菌,4:誘導E.coli BL21/pET32agpsB重組菌,5:誘導E.coli BL21/pET32agpsB上清,6:誘導E.coli BL21/pET32agpsB沉淀。

2.5rGpsB的鑒定 蛋白經純化濃縮后，進行Western-blot分析。rGpsB分別與His-Tag單克隆抗體、GpsB多克隆抗體反應均出現單一條帶。(圖5)

A:重組蛋白 Western-blot分析, M:蛋白分子質量標準, 1: rGpsB與His-Tag 單克隆抗體反應條帶, B:重組蛋白Western-blot 分析, M:蛋白分子質量標準, 1: rGpsB與GpsB多克隆抗體反應條帶。

2.6GpsB鼠多抗血清效價 BALB/c小鼠經免疫得到GpsB鼠多抗血清，ELISA測定抗體效價為1∶102 400。

3 討 論

GpsB的晶體結構研究發現，GpsB通常由100個氨基酸組成，含有兩個結構域，65-70個氨基酸組成N端結構域，是蛋白的脂質結合域[13]，20-25個氨基酸組成C端結構域。N端結構域和C端結構域分別組裝成二聚體和三聚體，但全長GpsB蛋白是六聚體[14]。從結構和功能等各方面來看，GpsB和另一種分裂蛋白DivIVA都存在相似性，并且兩個蛋白可發生相互作用。在前期課題組的研究中發現，DivIVA屬于S.suis2的一種毒力因子，與細菌生長分裂有關。DivIVA基因缺失時，細菌無明顯的鏈狀結構，多數菌體聚集成團，生長受到嚴重阻礙，突變株基本無致病性[15]。作為DivIVA的同源蛋白，GpsB在S.suis2中是否也發揮同樣的作用仍有待考證。

GpsB在革蘭陽性菌細胞壁的合成中發揮著重要作用。在李斯特菌中，敲除株細胞壁的功能性變弱，對β-內酰胺的耐受性減弱，細胞更易自溶[16-17]。而在肺炎鏈球菌中，gpsB突變體在細胞分裂隔膜的閉合中存在缺陷，因此細胞呈長條狀，Z 環呈不規則形狀[16,18]；GpsB 通過抑制PBP2x 來調節外周肽聚糖(peptidoglycan，PG)的合成，這對隔膜的閉合起著至關重要的作用。另外在枯草芽孢桿菌中，gpsB、ezrA雙敲除株細胞伸長，并且容易發生自溶[19]，這極有可能是gpsB的突變導致肽聚糖合成的機器—PBP1定位錯誤，從而不能正確合成肽聚糖，影響了細胞壁的合成。GpsB不僅與細胞壁合成有關，并參與磷酸化調節[20]。在枯草芽孢桿菌中研究發現，GpsB能被真核樣絲/蘇氨酸激酶(Serine/threonine kinase，STK)磷酸化，STK同時也受到GpsB磷酸化的負反饋調節[5]。在肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)中發現，GpsB通過磷酸化分裂蛋白DivIVA，來減弱其在細胞伸長方面的作用[21]。GpsB蛋白的第75位的蘇氨酸可被PrkC磷酸化，但并不調節細胞分裂過程，而是PrkC功能所需，可能是負反饋調節的一部分[22]。由此可見，GpsB蛋白是一個多功能蛋白，在各菌中發揮的作用也不盡相同。但關于該蛋白在豬鏈球中的作用未見相關報道，因此該蛋白在豬鏈球中的作用具有研究意義。

本實驗首先根據目的基因序列設計引物，PCR擴增后獲得目的基因克隆，并將其連接到pET32a表達載體上，成功構建出重組表達載體。利用IPTG誘導的方式，在原核表達系統中獲得目的蛋白。目的蛋白超聲破碎后經SDS-PAGE鑒定發現，蛋白主要存在于上清中且條帶顏色較深，說明蛋白活性較高且表達量較多。利用Ni離子親和層析柱純化上清中的蛋白，經濃縮后蛋白純度較高。分別以His-Tag 單克隆抗體和GpsB蛋白多克隆抗體為一抗進行Western blot 鑒定，結果顯示反應均出現單一條帶，無雜帶，結果表明實驗成功制備出rGpsB，且純度較高。利用重組蛋白制備的多抗血清經ELISA測定效價為1∶102 400，制備的多抗血清可用于后續實驗。本研究結果為進一步研究gpsB在S.suis2中的作用奠定了基礎。