野生水鳥感染霍亂弧菌和沙門菌等病原菌的分離和鑒定

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野生動(dòng)物被認(rèn)為是“病原的天然儲(chǔ)存庫(kù)”，許多烈性的人類傳染病如SARS和埃博拉等，其感染和傳播的源頭都指向野生動(dòng)物。近些年來，遷徙鳥類傳播禽流感的風(fēng)險(xiǎn)也引起全社會(huì)的廣泛關(guān)注[1-2]。實(shí)際上，遷徙的野生鳥類還可能攜帶和傳播各類主要經(jīng)腸道感染的病原細(xì)菌[3]，一方面可能對(duì)水源環(huán)境和水產(chǎn)養(yǎng)殖造成污染，另外也可能直接或間接的導(dǎo)致人類感染疾病[4]，由此產(chǎn)生的生物安全和公共衛(wèi)生問題也值得關(guān)注。但是，野生鳥類感染和傳播人獸共患病原細(xì)菌的報(bào)道，特別是來自國(guó)內(nèi)的報(bào)道非常少。2017年8月，內(nèi)蒙古自治區(qū)某濕地自然保護(hù)區(qū)內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量的野生鳥類死亡，本單位采集部分死亡鳥類的組織標(biāo)本，分離和初步鑒定出霍亂弧菌和沙門菌等多種腸道感染相關(guān)的病原菌，本研究可為遷徙野生鳥類攜帶人獸共患病原菌的科學(xué)和疾病防控研究提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1儀器設(shè)備 細(xì)菌鑒定使用美國(guó)BD公司Phoenix100型全自動(dòng)微生物鑒定儀，其它為細(xì)菌學(xué)試驗(yàn)用常規(guī)儀器。

1.1.2菌株 都柏林沙門菌參考菌株和O1型霍亂弧菌分離株為本室保存的菌株。

1.1.3培養(yǎng)基及試劑 細(xì)菌培養(yǎng)基和厭氧產(chǎn)氣包購(gòu)自青島海博生物公司；Trizol試劑為Invitrogen公司產(chǎn)品；PrimeScriptTMRT reagent Kit、PCR Master Mix和DNA Maker等為TaKaRa公司產(chǎn)品；引物合成和測(cè)序由吉林省庫(kù)美生物公司完成。

1.2 方法

1.2.1標(biāo)本采集和運(yùn)輸 采集的死亡鳥類推斷死亡時(shí)間均在1 d以內(nèi)，個(gè)體保存完整，觀察體表無明顯的潰爛和傷口；解剖觀察各臟器沒有明顯的出血和壞死病灶，僅腸道有充血或輕微出血的病變。無菌采集心、肝、脾和肺等組織標(biāo)本，并剪取一段病變部位的腸段，放在無菌采樣管中，然后放入采樣箱中加冰袋運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。

1.2.2細(xì)菌分離培養(yǎng) 組織標(biāo)本在腦心浸液瓊脂和胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸(TSC)瓊脂平板上劃線接種，分別在需氧和厭氧的條件下培養(yǎng)。

1.2.3細(xì)菌鑒定 需氧分離培養(yǎng)的典型單菌落首先進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢觀察，然后選擇對(duì)應(yīng)的細(xì)菌鑒定卡使用Phoenix100微生物鑒定儀進(jìn)行鑒定；厭氧分離培養(yǎng)的細(xì)菌挑取黑色的單菌落；所有獲得的菌株同時(shí)使用通用引物測(cè)定16s rRNA序列，利用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，鑒定細(xì)菌種屬。

1.2.4細(xì)菌毒力基因的PCR鑒定 霍亂弧菌和沙門菌相關(guān)毒力基因的PCR鑒定引物如表1所示，參考相關(guān)文獻(xiàn)合成[5-10]。產(chǎn)氣莢膜梭菌參考相關(guān)文獻(xiàn)[11]合成4種主要毒素基因(α、β、ε和ι毒素)的鑒定引物，基于PCR鑒定的結(jié)果確定毒素型。

1.2.5病毒核酸檢測(cè) 組織標(biāo)本勻漿后使用Trizol試劑提取總RNA，參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《禽流感病毒RT-PCR檢測(cè)方法 NY/T 772-2013》和《新城疫診斷技術(shù) GB/T 16550-2008》規(guī)定的RT-PCR方法檢測(cè)禽流感和新城疫病毒的核酸。

表1 霍亂弧菌和沙門菌PCR鑒定引物Tab.1 Primers used for identification of Vibrio cholerae and Salmonella sp.

2 結(jié) 果

2.1細(xì)菌分離鑒定結(jié)果 共采集4只死亡野鳥的病料組織標(biāo)本，細(xì)菌分離鑒定的結(jié)果如表2所示。其中有1只死亡的赤頸潛鴨在本研究培養(yǎng)條件下未分離到任何的病原細(xì)菌，有2只野鳥(鸕鶿和骨頂雞)分離到霍亂弧菌，2只野鳥(紅嘴鷗和骨頂雞)分離到沙門菌，其它分離到的致病菌和條件致病菌還包括產(chǎn)氣莢膜梭菌、溫和氣單胞菌和類志賀鄰單胞菌等。

表2 野鳥的病料組織標(biāo)本細(xì)菌分離鑒定結(jié)果Tab.2 Isolation and identification of pathogenetic bacteria from diseased tissue of wild birds

2.2產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素分型結(jié)果 經(jīng)PCR鑒定，所有分離菌株僅α毒素基因鑒定為陽(yáng)性，其它3種毒素鑒定均為陰性，說明本次分離的產(chǎn)氣莢膜梭菌均為毒素A型。

2.3霍亂弧菌毒力基因的鑒定結(jié)果 PCR鑒定的結(jié)果如表3所示，本次分離的菌株檢測(cè)霍亂弧菌特異性膜蛋白o(hù)mpW和溶血素hlyA基因?yàn)殛?yáng)性，而檢測(cè)O1和O139血清群的特異性rfb基因以及霍亂毒素ctxA基因、霍亂毒素相關(guān)的菌毛和ChxA毒素基因均為陰性。說明本次分離的霍亂弧菌不屬于O1和O139血清群，也不攜帶霍亂毒素。

表3 霍亂弧菌毒力基因的PCR鑒定結(jié)果Tab.3 PCR result of Vibrio cholerae virulence genes

2.4沙門菌毒力基因的鑒定結(jié)果 經(jīng)PCR鑒定，本次分離的菌株檢測(cè)沙門菌侵襲基因invA和四氫葉酸還原酶結(jié)構(gòu)蛋白基因ttrBCA均為陽(yáng)性，檢測(cè)sefA菌毛基因?yàn)殛幮裕及亓稚抽T菌參考菌株檢測(cè)3種基因均為陽(yáng)性。

2.5病毒核酸檢測(cè)結(jié)果 經(jīng)RT-PCR鑒定，所有標(biāo)本檢測(cè)禽流感和新城疫病毒的核酸均為陰性。

3 討 論

從本次死亡野鳥的病料標(biāo)本中分離到多種的病原細(xì)菌，其中類志賀鄰單胞菌和溫和氣單胞菌等是人或動(dòng)物臨床常見的條件致病菌和繼發(fā)感染的細(xì)菌；產(chǎn)氣莢膜梭菌也是環(huán)境和動(dòng)物腸道內(nèi)的常在菌，在特殊條件下可能異常的聚積、增殖并產(chǎn)生毒素，導(dǎo)致動(dòng)物急性發(fā)病死亡[12]，也可能導(dǎo)致人類的食物中毒性疾病。而在傳統(tǒng)意義上，霍亂弧菌和沙門菌都是能夠引起原發(fā)性腸道感染的病原菌。

霍亂弧菌較多分布在河流入海口等有一定鹽度的水生態(tài)環(huán)境中[6-7]，其O1和O139血清群攜帶霍亂毒素，能夠激活腸上皮細(xì)胞的腺苷酸環(huán)化酶，引起cl-離子的分泌和Na+離子的吸收障礙，水伴隨著離子進(jìn)入腸腔，引起嚴(yán)重的水樣腹瀉。而其它非O1/O139血清群菌株也可能攜帶其它的毒力因子，導(dǎo)致腹瀉或者其它的感染疾病。例如，近些年新鑒定的cholix毒素(ChxA)[13]，是一種真核細(xì)胞延伸因子2(eEF2)特異的ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶，可阻止細(xì)胞的蛋白合成，表現(xiàn)強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性。本次分離的菌株非O1/O139血清群，沒有霍亂毒素和cholix毒素，可能并非高致病性的菌株。但是這些低致病性的菌株分布在水環(huán)境中，并且可能被遷徙的候鳥攜帶進(jìn)行更廣泛的傳播，也會(huì)在霍亂弧菌毒力菌株的進(jìn)化中發(fā)揮重要的作用。

沙門菌是世界范圍內(nèi)最常見的食源性疾病的病原菌，分為不同的血清型。本研究中鑒定的3種毒力相關(guān)基因，invA和ttrBCA存在于所有血清型的菌株中，也是沙門菌屬最常用的特異性鑒定基因[9-10]。而sefA是沙門菌SEF14菌毛的編碼基因，該菌毛主要存在于腸炎沙門菌(S.Enteritidis)和禽病相關(guān)血清型等O抗原D1群的菌株中[14]。本次分離的菌株都不攜帶該菌毛的編碼基因，初步判定并非腸炎沙門菌和引起雞白痢和禽傷寒的S.Pullorum和S.Gallinarum等主要禽病相關(guān)的血清型。下一步的工作中，擬使用沙門菌屬的診斷血清試劑盒鑒定本次分離菌株的血清型，并評(píng)估其感染致病的風(fēng)險(xiǎn)。

本次的野生水鳥死亡事件，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢查排除禽流感等高風(fēng)險(xiǎn)的病毒性感染，分離到霍亂弧菌和沙門菌等可導(dǎo)致人類腸道感染的病原細(xì)菌。具體的病因還有待商榷，因?yàn)椴⒉皇撬械镍B類都分離到統(tǒng)一的病原菌，病死鳥解剖也沒有觀察到典型的禽類沙門菌病或產(chǎn)氣莢膜梭菌感染導(dǎo)致的多臟器的炎癥、壞死和出血等病變。推測(cè)病因可能是環(huán)境應(yīng)激或者食物匱乏等因素導(dǎo)致的鳥類自身抵抗力下降并伴有病原菌的入侵等綜合因素。但是通過本次事件，遷徙的鳥類攜帶的病原細(xì)菌對(duì)水源環(huán)境和水產(chǎn)養(yǎng)殖可能造成的污染，繼而導(dǎo)致的生物安全和公共衛(wèi)生問題值得關(guān)注。本次發(fā)現(xiàn)的骨頂雞、鸕鶿和紅嘴鷗等死亡鳥類都是北方常見的夏候鳥，一些抵抗力弱的鳥類死亡可能污染當(dāng)?shù)厮|(zhì)，而其它候鳥隨著遷徙季節(jié)到來還可能將這些病原細(xì)菌擴(kuò)散到更大的范圍。因此，對(duì)遷徙鳥類及其主要棲息地的水質(zhì)等進(jìn)行持續(xù)的監(jiān)測(cè)是保護(hù)生態(tài)環(huán)境重要的環(huán)節(jié)。