基于RNA恒溫擴增技術分析天津地區呼吸道感染住院兒童肺炎支原體感染的流行病學特點

， ， ， ，李超，，

支原體是介于細菌和病毒之間，無細胞壁并能夠獨立生存的最小微生物。肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae，MP)是引起呼吸道感染的常見病原體，通過飛沫傳播，兒童感染最為多見，可發生于各個年齡段，全年可見，其發病率與性別、年齡、季節、地區有一定相關性[1]。MP可引起急性上呼吸道感染、支氣管炎和支氣管肺炎(Mycoplasmapneumoniaepneumonia，MPP)以及溶血性貧血、腦膜炎、心肌炎、腎炎等肺外并發癥。嬰幼兒MPP起病急，病程長，病情重，表現為發熱、劇咳、呼吸困難和喘憋等，但其臨床表現不是十分典型，容易誤診，從而延誤治療。MPP占兒童肺炎的 10%～20%，流行年份可達30%[2-3]。在大于5歲的兒童中，MP引起超過40%的社區獲得性肺炎。在每4～7年一次的MP流行中，由MP導致的社區獲得性肺炎會成倍增加。輕型MP感染性疾病尤其是支氣管炎比社區獲得性肺炎多至少20倍，但近20%的MP感染無臨床癥狀[4]。因此掌握兒童MP感染的流行病學特點，使用快速、準確、低成本的檢測方法很有必要[5]。

基于實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術(Simultaneous Amplification and Testing，SAT)的MP-RNA檢測直接以病原體特異性RNA為擴增靶標，使用M-MLV反轉錄酶、T7 RNA多聚酶和優化探針進行恒溫擴增，具有無創、快速、操作簡單及高診斷準確性等優點。目前SAT技術已應用于肺結核、泌尿生殖道沙眼衣原體和淋球菌等病原體的檢測，亦見于少數對支原體檢測的報道[6-7]，但上述報道均為方法學研究，目前尚無基于SAT技術的關于MP的流行病學報道。為了解天津地區MP流行病學特點，為臨床診斷和治療提供參考，本研究選取2016年5月-2018年5月在天津市兒童醫院擬診斷為呼吸道感染的住院患兒1 782例，對其MP-RNA檢測結果及其他臨床資料進行比較分析，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1研究對象 選擇2016年5月-2018年5月在天津市兒童醫院擬診斷為呼吸道感染的住院患兒1 782例作為研究對象，其中男性患兒975例，女性患兒807例，男女比例1.21∶1.00，年齡在1月-16歲之間。全部病例標本均進行MP-RNA檢測，其中560例同時進行MP-DNA檢測。統計標本入選：以患兒首次入院首次檢測的標本為準，如同時檢測多種標本，以陽性標本為準。臨床診斷標準依據《諸福棠實用兒科學》第八版[2]。

1.2試劑和儀器 試劑使用上海仁度生物科技有限公司的MP核酸檢測試劑盒(RNA恒溫擴增)和中山大學達安基因股份有限公司的MP核酸檢測試劑盒(PCR熒光探針法)，儀器使用ABI Prism 7500熒光定量PCR儀。

1.3 標本處理與檢測

1.3.1MP-RNA檢測 RNA提取及反應體系配置：取新鮮肺泡灌洗液、咽拭子、痰液或胸腹水標本，肺泡灌洗液使用原標本，咽拭子中加入1 mL生理鹽水浸泡混勻，痰液用4倍生理鹽水稀釋混勻，胸腹水使用原標本；取200 μL標本，先后加入200 μL裂解液和100 μL核酸提取液并依次混勻；陰陽性對照按使用說明書配置；60 ℃保溫5 min，室溫平衡10 min；使用磁珠分離裝置分離磁珠并清洗兩次；用40 μL擴增檢測液與磁珠混勻，最后取30 μL混合液置于微量反映管中，60 ℃保溫10 min，42 ℃保溫5 min，完成提取。30 μL上述提取液中加入10 μL酶液組成40 μL最終反應體系。

反應程序設置：42 ℃ 1 min，40個循環；熒光素通道設定為F1(FAM)和F2(HEX或者VIC)，熒光信號每分鐘收集一次。

陽性結果判定：F1通道Ct≤35且溶解曲線在64±5 ℃區間有吸收峰，F2通道有或者無數值的樣本為陽性；F1通道35

1.3.2MP-DNA檢測 DNA提取及反應體系配置：痰液用4倍生理鹽水稀釋混勻，4 ℃冰箱過夜，咽拭子中加入1.5 mL生理鹽水浸泡混勻,4 ℃冰箱過夜，肺泡灌洗液和胸腹水使用原標本；取上述標本1 mL至1.5 mL離心管中，12 000 r/min離心5 min；去上清，沉淀中加入50 μL DNA提取液充分混勻，100 ℃恒溫處理10 min，12 000 r/min 離心5 min備用。陰陽性對照按使用說明書配置。40 μL MP PCR反應液、 3 μL Taq酶及2 μL樣品處理上清液組成最終反應體系。

反應程序設置：93 ℃ 2 min；93 ℃ 45 s，55 ℃ 60 s，10個循環；93 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，30個循環。

陽性結果判定：擴增曲線呈S型且Ct值<30,則結果為陽性。

2 結 果

2.1MP感染總體情況 本研究共檢測擬診斷為呼吸道感染的住院患兒1 782例，MP-RNA結果為陽性者709例，總陽性率39.79%。同時進行MP-RNA和MP-DNA檢測的患兒共560例，其中MP-RNA陽性者430例，陽性率為76.79%，MP-DNA陽性者450例，陽性率為80.36%。

2.2MP感染的性別差異 本研究中男性患兒MP檢出率(指MP-RNA，下文未注明者均同)為36.62%(357/975),女性患兒MP檢出率為43.63%(352/807)。女性患兒MP檢出率高于男性患兒(表1)，兩者差異有統計學意義(χ2=9.04，P<0.05)，可推測天津地區呼吸道感染住院患兒的MP整體檢出率女性高于男性。

表1 MP感染的性別分布Tab.1 Gender distribution of MP infection

2.3不同年齡患兒MP檢出率比較 本研究中男性患兒的平均年齡為(4.45±3.37)歲；女性患兒的平均年齡為(5.01±3.34)歲，兩者平均年齡比較差異有統計學意義(t=3.54，P<0.05)，女性患兒年齡略高于男性。在不同年齡組分布方面，新生兒與嬰兒組、幼兒組、學齡前期組和學齡期組患兒MP檢出率分別為9.79%(32/328)、 26.28%(123/468)、48.08%(225/468)和63.51%(329/518)。不同年齡組MP檢出率比較差異有統計學意義(χ2=294.25，P<0.05)，其中新生兒與嬰兒組最低，學齡期組最高，MP檢出率隨著年齡的增大而增高(表2)。

表2 MP感染的年齡分布Tab.2 Age distribution of MP infection

2.4不同月份(季節/年份)MP檢出率比較 天津地區MP感染全年可見，圖1列出了2016年5月-2018年5月這一時期內不同月份(1-12月)呼吸道感染患兒的MP檢出率，可以看出不同月份間MP檢出率有很大不同，其中9月份最高，達64.52%，4月份最低，為18.47%。若依照季節對表中數據進行整理，我們可以得出，天津地區春(3-5月)、夏(6-8月)、秋(9-11月)、冬(1-2，12月)四季呼吸道感染患兒的MP檢出率分別為23.15%(141/609)、31.65%(25/79)、59.50%(216/363)和44.73%(327/731)。秋季呼吸道感染患兒MP檢出率明顯高于其他季節，秋冬季MP檢出率高于春夏季(χ2=114.70，P<0.05)。若按自然年劃分，2016、2017和2018年度天津地區呼吸道感染患兒MP檢出率分別為：55.27%(173/313)、50.58%(395/781)和20.49%(141/688)。

圖1 天津地區不同月份呼吸道感染住院患兒MP感染率Fig.1 MP infection rate of hospitalized children with respiratory tract infection in Tianjin in different months

2.5標本類型對MP-RNA陽性率的影響 此研究中MP檢測共有4種標本類型：肺泡灌洗液、痰液、咽拭子和胸腹水，其MP-RNA陽性率分別為77.89%(391/502)、20.38%(161/790)、32.15%(154/479)和27.27%(3/11)。不同標本類型間MP-RNA陽性率比較差異有統計學意義(χ2=440.78，P<0.05)，肺泡灌洗液MP-RNA陽性率明顯高于其他標本類型(表3)。

表3 不同標本類型中MP-RNA陽性率 Tab.3 Positive rate of MP-RNA in different specimen types

2.6MP-RNA檢測結果與MP-DNA檢測結果的比較 為探究RNA檢測與DNA檢測在MP檢測中不同，遂對本研究中同時進行MP-RNA檢測和MP-DNA檢測的560份標本的檢測結果進行比較(表4)，兩者具有較好的一致性(Kappa=0.704，P<0.001)，一致率為73.57%(412/560)；MP-RNA檢測陽性率為76.79%(430/560)，低于MP-DNA檢測陽性率(80.36%)(450/560)，且兩者差異具有統計學意義(McNemar檢驗：P< 0.05)。

表4 MP-RNA和MP-DNA檢測結果比較Tab.4 Text results comparison of MP-RNA and MP-DNA

3 討 論

MP感染是一種全球感染性疾病，以呼吸道感染最常見，患者為主要的傳染源，通過飛沫經呼吸道傳播，尤其多見于兒童。MP感染與性別、年齡以及季節有一定關系，不同性別和年齡患兒的MP發病率情況在不同地區具有一定的一致性，而不同地區患兒的MP檢出率則不盡相同[8]。

MP感染診斷中，血清特異性抗體檢測是目前最常見的方法，以往兒童MP感染流行病學分析多使用此方法，但其缺陷在于較難鑒別急性感染或既往感染。近年來分子診斷技術廣泛應用于MP診斷領域，包括常規PCR、巢式PCR、實時熒光定量PCR等。與血清學方法相比，PCR方法敏感度、特異性和可靠性更高，而且不受患兒免疫狀態的影響，有利于MP感染的早期診斷[9]。MP-DNA(PCR)檢測技術的不足之處在于其不依賴于MP的存活狀態，陽性結果無法區分急性感染、無癥狀感染和感染后的持續攜帶狀態，有研究顯示，動態檢測MP感染后其DNA持續攜帶的中位數時間為7周，個別可長達7個月之久[10-11]。作為RNA檢測技術之一的SAT技術以特異性RNA為靶標，由于RNA在菌體中含量較高且只存在于活體菌株中，SAT技術可提高病原體檢出的敏感度和特異性，能夠即時反映病原體感染情況，使診斷具有更高的準確率，可作為檢測病原體感染的可靠方法[12-13]。本次檢測中有560份標本在進行MP-RNA檢測的同時進行了MP-DNA檢測，其中有56份標本的檢測結果不同，當中18份標本的MP-DNA結果為陰性，而MP-RNA的結果為陽性；38份標本的MP-DNA結果為陽性，而MP-RNA結果為陰性。查閱這些病例的臨床及血清學檢測結果，發現前者標本多在疾病早期留存，而后者患兒多在住院前已進行過有針對性的抗生素治療，前者血清學檢測結果陽性率及抗體滴度亦明顯低于后者，提示MP-DNA陰性而MP-RNA陽性者多見于早期MP感染患兒，而MP-DNA陽性且MP-RNA陰性者多見于疾病治療后的恢復期。這些結果表明SAT技術比MP-DNA檢測具有更高的靈敏度，更適合于早期診斷，亦更適用于MP感染后治療和恢復情況的監測。

本研究基于SAT技術共檢測住院呼吸道感染患兒1782例，MP-RNA結果陽性者709例，總陽性率39.79%。最近幾年國內呼吸道感染患兒MP檢出率中，東北地區有報道30.19%[14]，西北地區有報道30.79[15]，長江三角洲地區有報道20.97%[16]，西南地區有報道27.01%[17]，華北地區此前有報道27.23%[18]。比較上述各地區MP檢出率，變化較大，但以此次天津地區MP檢出率為最高，分析其原因，一方面檢測方法不同，上述文獻報道均使用血清學檢測方法，而此次報道采用SAT技術；另一方面可能與標本類型有關，此次檢測中肺泡灌洗液所占比例較大且其陽性率遠高于其他類型標本，高達77.89%(391/502)(表3)；此外不能排除天津地區住院患兒MP感染(攜帶)率原本高于其他地區的可能性。目前國內外針對肺泡灌洗液的MP核酸檢測尚少見，國外曾有研究者收集319例患有慢性呼吸系統疾病的患兒的肺泡灌洗液，并利用PCR方法檢測其MP-DNA，結果顯示10%的患兒MP-DNA陽性[19]，這與此次檢測結果有一定差別，其中原因有待進一步研究。

以往報道中，不同性別間MP檢出率差異不盡一致，到目前為止尚無明確證據表明MP感染存在性別差異。本次檢測結果顯示，男性患兒MP感率為36.63%，女性患兒MP感率為43.62%，女性高于男性,兩者差異有統計學意義。MP感染可發生于兒童各年齡段，國內外報道均顯示MP感染發病的高峰期為學齡前期和學齡期兒童[8,20]，本次檢測結果顯示，天津地區各年齡段呼吸道感染住院兒童MP檢出率有顯著差異，結果具有統計學意義，MP檢出率隨著年齡的增大而增大，學齡前期尤其是學齡期患兒MP檢出率明顯高于其他年齡組患兒，這與上述以往研究相一致。分析其原因，學齡期兒童走出家庭進入人員密集環境，一方面在適應的過程中免疫力下降，另一方面被傳染的概率大大增加。

MP感染見于全年各個季節和月份，不同地區的高發季節并不相同。在國內MP檢出率的問題上，以往觀點多以南北方論，認為北方多發于冬春季，南方多發于夏秋季，但部分研究并不支持這一觀點。地處我國北方的北京地區秋冬季MP檢出率明顯高于春夏季[21]，地處長江三角洲地區的南京以夏半年較多，其春夏季的MP檢出率高于秋冬季[22]。而同屬南方，位于珠江三角洲地區的廣州的冬季的MP檢出率高于其他季節[23]。研究顯示MP感染與環境溫度和濕度呈正相關，溫度和濕度可能才是MP感染和致病的更直接因素，而非直接取決于地域或氣候[24]。本次檢測顯示，天津地區呼吸道感染住院患兒MP檢出率秋季最高，且秋冬季明顯高于春夏季。這與上述北京地區研究結果基本一致。此外，MP感染每隔幾年就會在大范圍的區域內出現一次周期性流行，從2010年起，歐洲地區尤其是歐洲北部國家MP檢出呈現上升趨勢，同時期的其他地區如巴西、以色列、韓國和日本也出現流行[25]。從2011年至2013年，中國北方地區出現一次明顯的MP感染流行，2014年至2016年MP感染又進入低潮期[26]。此次報道天津地區MP檢出率呈整體下降趨勢，周期性流行趨勢有待更長時間的監測。

綜上所述，RNA恒溫擴增技術是檢測MP感染的有效方法，具有較高的敏感度和準確率。天津地區呼吸道感染住院兒童MP總檢出率為39.79%，女性患兒檢出率高于男性；MP感染可發生在各年齡段兒童且會隨著年齡的增大而增高，其中學齡期兒童MP檢出率最高；MP感染見于全年，秋冬季MP檢出率高于春夏季，秋季檢出率明顯高于其他季節。